《International Journal of Molecular Sciences》：In Silico Single-Cell Transcriptomic Analysis Reveals Senescence-Associated Programs’ Progress Along the Normal–Adenoma–Carcinoma Sequence in Colorectal Cancer
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结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）通过从正常结肠黏膜经腺瘤最终发展为癌的多阶段过程进展。然而，在这一转变过程中，特定细胞类型的衰老相关状态仍未完全阐明。研究人员对来源于正常黏膜、腺瘤性息肉和原发性CRC组织的单细胞RNA测序（single
结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）通过从正常结肠黏膜经腺瘤最终发展为癌的多阶段过程进展。然而，在这一转变过程中，特定细胞类型的衰老相关状态仍未完全阐明。研究人员对来源于正常黏膜、腺瘤性息肉和原发性CRC组织的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）及空间转录组学（spatial transcriptomics）数据集进行了整合分析。分析结果显示，从正常黏膜经腺瘤到癌，衰老相关转录评分呈渐进性升高，其中恶性组织的衰老评分最高。这种升高在上皮细胞和单核细胞中尤为显著。细胞间通讯（cell-cell communication）分析显示，高衰老评分细胞与B细胞群体之间，主要通过巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）–CD74/CXCR4受体复合物，MIF信号增强。空间转录组学分析进一步显示，高衰老评分区域优先定位于肿瘤侵袭边缘或其邻近区域，并靠近基质区域，表明衰老相关程序可能参与了CRC微环境的空间组织。综上所述，这些发现支持一种以衰老为中心的结直肠肿瘤演化模型，其中上皮细胞、髓系和淋巴系衰老相关状态逐渐积累并通过旁分泌信号网络相互作用。MIF–CD74/CXCR4轴可能是衰老相关肿瘤-免疫相互作用的候选介质，也是潜在的治疗靶点。
结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球癌症相关发病与死亡的主要原因之一，其发展遵循从正常结肠黏膜经腺瘤癌前病变最终进展为侵袭性癌的多步骤路径，即腺瘤-癌序列（adenoma-carcinoma sequence）。该过程不仅由上皮细胞内遗传与表观遗传异常的逐步累积驱动，还伴随肿瘤免疫与基质微环境的动态重塑。然而，细胞衰老（Cellular Senescence）在这一过程中的作用，特别是在肿瘤起始、进展及治疗反应中的角色，仍不清楚。细胞衰老是一种持久的细胞周期阻滞状态，具有抗凋亡能力、代谢与染色质重塑及细胞间通讯改变等特征，可由端粒缩短、癌基因激活、DNA损伤、氧化应激及线粒体功能障碍等诱导。衰老细胞最初被认为是内在抑癌机制，但在癌前病变中，癌基因诱导的衰老（oncogene-induced senescence）可限制转化细胞扩增。然而，持续存在的衰老细胞可通过衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）发挥促瘤效应，招募或重编程免疫细胞，重塑细胞外基质，促进肿瘤侵袭。目前，这些衰老相关程序在CRC演进中的细胞来源、通讯通路及空间组织仍 poorly defined，限制了针对衰老相关肿瘤-免疫相互作用的干预策略开发。
研究人员整合了来自四个未经治疗且微卫星稳定（microsatellite stability）的CRC患者的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据（GSE161277），涵盖正常黏膜、癌旁组织、腺瘤及原发性癌组织共12个样本39,365个细胞，并联合来自GSE294385的八个原发性CRC空间转录组学（spatial transcriptomics）样本（10× Genomics Visium平台）。研究旨在：（1）确定衰老相关转录活性是否沿正常-腺瘤-癌序列递增；（2）识别最显著的上皮、免疫及基质细胞群；（3）刻画涉及高衰老评分细胞的阶段特异性受体-配体相互作用；（4）定义CRC组织内衰老相关细胞状态的空间生态位。通过整合多种衰老特征、SASP评分、细胞间通讯推断及空间邻域分析，研究人员构建了细胞类型分辨率且具备空间信息的衰老模型。结果显示，衰老相关转录评分自正常黏膜经腺瘤至癌呈渐进性升高，在上皮细胞与单核细胞中尤为显著；高衰老评分区域优先定位于肿瘤侵袭边缘及邻近基质区域；CellChat分析显示MIF–CD74/CXCR4信号轴在高衰老评分上皮细胞与B细胞间通讯中占主导地位。这些发现支持一种以衰老为中心的结直肠肿瘤演化模型，为CRC的上下文特异性治疗策略及生物标志物开发提供了新的理论依据。
主要技术方法包括：利用Seurat（version 5）对scRNA-seq数据进行质控、对数归一化（log-normalization）、高变基因选择、主成分分析（principal component analysis, PCA）、Harmony批次校正及基于经典标志基因的手动细胞类型注释。通过整合SenMayo、Fridman、CellAge核心基因集、细胞周期阻滞基因集及DNA损伤反应（DNA damage response, DDR）相关基因集等11个curated基因集，计算模块评分并构建综合Senescence Index。高衰老评分细胞通过Senescence Index的前十分位阈值进行鉴定。细胞间通讯分析采用CellChat（version 1.6.1）推断配体-受体互作网络。空间转录组学数据分析则利用spacexr的RCTD方法将单细胞衰老注释反卷积至Visium spots，并采用局部空间自相关指标（local indicators of spatial association, LISA）识别衰老评分的空间聚类模式。
2.1 单细胞RNA测序数据集与衰老特征图谱概述
研究人员分析了来自四个CRC患者、跨越腺瘤-癌进展序列的39,365个单细胞，涵盖正常黏膜（11,886个细胞）、癌旁组织（3,290个细胞）、腺瘤（11,712个细胞）及癌组织（12,477个细胞）共12个样本。基于EPCAM、KRT8、COL1A1、CD68、CD3D等经典标志基因，细胞被注释为18种类型，包括上皮/肿瘤谱系、基质、髓系及淋巴系群体。12个curated衰老相关基因集中11个通过过滤保留下来，证实这些已建立的衰老基因面板在该CRC单细胞数据集中具有广泛适用性。
2.2 基因集水平的衰老和SASP评分沿疾病进展序列变化一致
对四个组织阶段的11个curated衰老/SASP/DDR模块评分可视化显示，几乎所有基因集在癌组织中表现出最宽的评分分布和最高的上四分位值；腺瘤组织相对于正常和癌旁组织，对多个SASP相关特征呈现暂时性升高，形成双相模式，提示衰老相关转录程序在癌前阶段已部分激活，并在进展为侵袭性癌时进一步放大。
2.3 成纤维细胞和髓系细胞表现出最高衰老评分
基于综合Senescence Index前十分位阈值，基质成纤维细胞表现出最高比例的高衰老评分细胞，随后为单核细胞及结肠上皮细胞群；而淋巴系及B细胞、浆细胞谱系衰老评分相对较低。空间转录组学分析显示，LISA定义的High-High聚类优先定位于肿瘤外周、侵袭前沿及邻近基质/免疫浸润区（87.3%），而肿瘤核心区域稀疏或无显著High-High聚类，提示衰老相关转录程序在肿瘤-宿主界面呈非均匀分布。
2.4 沿正常-腺瘤-癌序列全局衰老评分逐渐升高
在全局评分数据集中，综合Senescence Index显示衰老评分从正常黏膜经腺瘤到癌呈渐进性升高，尤其在上皮区室趋势明显，提示恶性进展伴随肿瘤内在衰老逃逸。
2.5 上皮群体表现出最明显的疾病阶段依赖性升高
对各细胞类型的Senescence Index进行分解发现，恶性上皮区室（癌相关上皮细胞、肿瘤干细胞样细胞）和结肠细胞向癌方向的Senescence Index升高最为显著。配对样本水平比较提示肿瘤干细胞样细胞和CD8+ T细胞的Senescence Index在三种组织间存在显著差异，但配对比较仅纳入3例患者，统计效能有限，结果应视为探索性初步观察。
2.6 CellChat分析鉴定出高衰老评分恶性上皮细胞（而非成纤维细胞）是衰老相关细胞间通讯的主导来源，汇聚于MIF和MK通路
CellChat通路水平聚合分析显示，MIF（MIF–(CD74+CD44)和MIF–(CD74+CXCR4)；总概率=9.13，104对显著配体-受体对）和MK（MDK–(ITGA4+ITGB1)等；总概率=3.07，124对）是癌微环境中与衰老细胞来源通讯相关的两大主导信号通路。高衰老评分恶性上皮细胞构成衰老相关出站信号的主导推断来源，主要靶向B细胞及髓系群体。B细胞接收了最高的累积衰老相关信号输入，随后为单核细胞和NK细胞。然而，这些结果反映了细胞数量加权后的信号景观，且属于探索性发现。
讨论与结论：
本研究提供了结直肠肿瘤发生过程中衰老相关转录程序的整合单细胞与空间视图。研究结果表明，衰老相关程序在细胞类型和空间区域上表现出显著异质性。从正常黏膜到腺瘤仅观察到适度的衰老相关评分增加，而在进展为癌时则出现更显著的升高，且该趋势得到多个独立基因特征的支持，表明其不依赖于单一基因集。然而，这些结果应被解释为衰老相关转录活性增加的证据，而非不可逆细胞衰老的确切证明，因为转录组特征本身无法完全区分细胞衰老与其他应激反应、分化状态或细胞周期改变。
在生物学合理性方面，早期腺瘤形成过程中，癌基因激活和复制应激可能诱导衰老样反应，从而构成恶性转化的屏障；而随着腺瘤进展为癌，持续的DNA损伤、染色体不稳定、代谢应激、缺氧及炎症信号可能共同促进衰老相关状态的累积。值得注意的是，恶性上皮细胞同时表现出衰老相关评分升高和SASP活性增加，提示肿瘤细胞可通过分泌多种炎症及重塑介质直接参与肿瘤微环境的塑造。与初始假设相反，成纤维细胞比例在恶性进展过程中并未增加；而T细胞群体（特别是CD8+和CD4+ T细胞）表现出衰老相关转录评分的升高。这些观察应区别于经典T细胞耗竭（exhaustion），本研究鉴定的T细胞群体可能代表衰老相关与耗竭相关的重叠状态。
细胞通讯分析进一步鉴定出涉及衰老高分细胞群与表达CD74/CXCR4受体复合物的B细胞亚群之间增强的MIF信号。MIF作为多效性细胞因子，在炎症、肿瘤进展、免疫细胞招募及巨噬细胞极化中发挥重要作用。然而，该通路目前应被视为需要进一步验证的候选机制。
在转化医学层面，鉴于衰老在肿瘤发生中的双重作用，治疗策略需根据疾病阶段和细胞背景进行定制。在癌前病变中，过早清除衰老细胞可能破坏保护性抑癌屏障；而在已建立的CRC中，持续性衰老相关细胞和SASP信号可能促进慢性炎症、基质活化、免疫功能障碍和治疗抵抗。因此，靶向CRC中的衰老可能需要选择性干预策略，包括衰老细胞清除疗法（senolytic therapies）、衰老形态疗法（senomorphic therapies）以及联合调节肿瘤细胞衰老相关程序与免疫功能障碍的方案。MIF–CD74/CXCR4轴可能在此治疗框架中具有重要意义，但其治疗价值仍有待实验确立。
研究结论翻译：
本研究提供了结直肠肿瘤发生过程中衰老相关程序的整合单细胞与空间视图。研究结果支持一种模型，即衰老相关转录活性从正常黏膜到腺瘤和癌逐渐增加，涉及上皮和免疫区室，并优先定位于肿瘤相关空间生态位。界定这些程序的功能角色、空间相互作用及其与免疫功能障碍的关系，可能有助于开发更精确的生物标志物和CRC的上下文特异性治疗策略。
