《International Journal of Molecular Sciences》：Suppressed Paracrine Signaling of Cystatin a from Keratinocytes to Fibroblasts and Endotheliocytes Delays Wound Healing in Diabetes
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糖尿病中受损的伤口愈合涉及表皮角质形成细胞与真皮细胞间通讯的破坏，但其潜在的调控因子仍未完全明确。本研究旨在探讨半胱氨酸蛋白酶抑制剂A（Cystatin A, CSTA）在糖尿病创面修复中的潜在作用。研究人员检测了高糖处理的角质形成细胞和糖尿病小鼠皮肤中的CS
糖尿病中受损的伤口愈合涉及表皮角质形成细胞与真皮细胞间通讯的破坏，但其潜在的调控因子仍未完全明确。本研究旨在探讨半胱氨酸蛋白酶抑制剂A（Cystatin A, CSTA）在糖尿病创面修复中的潜在作用。研究人员检测了高糖处理的角质形成细胞和糖尿病小鼠皮肤中的CSTA表达。通过RNA测序（RNA sequencing）和功能实验评估了重组CSTA对人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblasts, HDFs）和人真皮微血管内皮细胞（human dermal microvascular endothelial cells, HDMECs）的影响，并在糖尿病C57BL/6J小鼠伤口模型中评估了局部应用CSTA和卡泊三醇（calcipotriol）的效果。CSTA表达在高糖和糖尿病条件下降低。重组CSTA增强了成纤维细胞的迁移和增殖相关活性，促进了细胞外基质相关基因表达，并改善了内皮细胞的迁移和小管形成。局部CSTA治疗加速了伤口闭合，增加了CD31（cluster of differentiation 31）阳性血管结构，并增强了糖尿病小鼠的胶原沉积。卡泊三醇治疗同样改善了伤口修复结果。这些发现表明CSTA可能参与真皮修复过程的调控，并提示其在糖尿病伤口愈合中的潜在治疗意义，尽管内源性CSTA缺乏的因果贡献仍有待确立。
糖尿病是一种由胰岛素绝对或相对缺乏引起的慢性代谢性疾病，长期高血糖可损伤血管和周围神经，导致下肢末端感觉减退和血流不足，进而引发糖尿病足溃疡（Diabetic Foot Ulcers, DFUs）。临床数据显示，相当比例的溃疡患者可在12周内愈合，但复发率高，约20%的患者最终面临截肢。当前标准治疗仍主要依赖清创、感染控制、减压、敷料更换及血管优化，然而许多慢性创面始终无法闭合。现有研究指出，慢性难愈性创面并非单一细胞类型的缺陷，而是表皮与真皮细胞间协调修复程序的崩溃。传统上，角质形成细胞被视为恢复表皮覆盖的主要细胞，但伤口修复研究表明，它们还释放可溶性因子和细胞外囊泡，塑造真皮修复微环境，调控成纤维细胞迁移、胶原产生、基质重塑和创面收缩，同时影响内皮细胞迁移、小管形成及血管新生。目前尚未明确的是，哪些角质形成细胞来源的功能因子在糖尿病创面中发生丢失，以及这种丢失是否足以独立导致修复功能障碍。半胱氨酸蛋白酶抑制剂A（Cystatin-A, CSTA）又称stefin A，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，主要存在于细胞内并由角质形成细胞分泌，构成皮肤主要生化屏障。既往研究证实CSTA具有抗凋亡功能，其基因突变与剥脱性皮肤综合征相关，近期研究还提示其参与皮肤老化过程中的旁分泌信号调控。然而，CSTA在角质形成细胞高糖环境下的表达变化及其对真皮细胞修复功能的影响尚未阐明。因此，研究人员系统开展本研究，旨在揭示CSTA在糖尿病创面修复中的潜在作用及分子机制，为探索基于CSTA的糖尿病创面治疗策略提供理论依据。
研究人员系统检测了高糖环境和糖尿病状态下CSTA的表达变化，并通过体外细胞实验与体内动物模型评估了外源性重组CSTA对真皮修复功能的影响。研究结果表明，高糖处理的角质形成细胞和糖尿病小鼠皮肤中CSTA表达均显著降低。在功能层面，重组CSTA可增强人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts, HDFs）的迁移和增殖活性，促进细胞外基质相关基因表达；同时改善人真皮微血管内皮细胞（Human Dermal Microvascular Endothelial Cells, HDMECs）的迁移、代谢活性及小管形成能力。在糖尿病C57BL/6J小鼠模型中，局部应用CSTA可显著加速创面闭合，增加CD31（cluster of differentiation 31）阳性血管结构并增强胶原沉积。此外，维生素D类似物卡泊三醇（calcipotriol）同样可改善糖尿病创面修复结局。这些发现提示，CSTA可能作为表皮与真皮细胞间通讯的关键调控因子参与真皮修复过程，在糖尿病创面愈合中具有潜在治疗价值，为开发靶向表皮-真皮交互作用的新型疗法提供了实验依据。
本研究采用的主要关键技术方法包括：利用链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ）诱导和高脂饮食建立C57BL/6J小鼠糖尿病模型，并通过直径1厘米的全层皮肤切除构建创面模型；以高糖（30 mM）处理人永生化角质形成细胞（HaCaT）模拟糖尿病微环境；采用RNA测序（RNA Sequencing, RNA-seq）技术分析重组CSTA干预后HDFs和HDMECs的转录组变化，结合京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析筛选相关通路；运用Transwell迁移实验、划痕实验、细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8, CCK-8）实验及小管形成实验评估细胞功能；通过实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blotting, WB）、免疫荧光、免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）及Masson三色染色检测分子表达与组织学改变。
2.1 CSTA在高糖处理的角质形成细胞和糖尿病小鼠皮肤中表达降低
研究人员通过qPCR、Western印迹及免疫荧光技术检测发现，高糖处理48小时后，HaCaT细胞中CSTA mRNA水平降至对照组的0.45倍，蛋白水平降至0.66倍，免疫荧光强度明显减弱；STZ诱导的糖尿病小鼠皮肤中CSTA mRNA和蛋白水平显著下调，免疫组化显示CSTA主要定位于角质层，且在糖尿病小鼠表皮中显著降低达79.54%。
2.2 基于RNA-seq转录组分析鉴定CSTA诱导的人真皮成纤维细胞变化
研究人员对重组CSTA处理后的HDFs进行RNA-seq分析，共鉴定出195个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），其中98个上调，97个下调。KEGG富集分析显示相关通路涉及类风湿关节炎、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子-受体相互作用；GO细胞组分分析提示细胞外空间、细胞外区域及含胶原的细胞外基质显著富集；分子功能和生物学过程分别涉及细胞因子活性、胶原结合以及血管生成正调控和细胞迁移。研究人员选择细胞外基质相关基因进行后续研究，通过STRING数据库构建蛋白互作网络，并筛选出4个代表性基因经qPCR验证。
2.3 CSTA促进成纤维细胞增殖和迁移
研究人员利用Transwell迁移实验、划痕实验及CCK-8实验评估CSTA对HDFs的功能影响。结果显示，重组CSTA刺激组迁移细胞数显著增加，48小时和72小时划痕闭合率分别提高14.08%和20.31%，CCK-8实验表明细胞代谢活性增强21.18%，证实CSTA可促进成纤维细胞迁移和增殖。
2.4 基于RNA-seq转录组分析鉴定CSTA诱导的人真皮微血管内皮细胞变化
研究人员对重组CSTA处理后的HDMECs进行RNA-seq分析，共鉴定出179个DEGs，其中104个上调，75个下调。KEGG和GO富集分析显示，CSTA处理与细胞外基质组织、细胞黏附及血管生成相关转录变化有关，涉及含胶原的细胞外基质、整合素结合、细胞外基质结构成分及生长因子活性等条目。蛋白互作网络分析筛选出20个相关基因，差异表达经可视化并通过qPCR验证。
2.5 CSTA增强内皮细胞迁移、代谢活性及小管形成
通过Transwell迁移实验、划痕实验、CCK-8实验及小管形成实验，研究人员发现CSTA处理后HDMECs迁移细胞数显著增加，48小时划痕闭合率提高21.42%，代谢活性增强17.62%。小管形成实验显示，CSTA刺激后血管生成相关指标连接点、网格数及总网格面积显著增加达2.07倍，表明CSTA促进真皮内皮细胞的迁移、增殖及血管生成能力。
2.6 局部给予CSTA加速糖尿病小鼠创面愈合并促进血管生成和胶原沉积
研究人员在糖尿病小鼠创面局部应用重组CSTA，观察到与生理盐水对照组相比，CSTA治疗组从第5天起创面闭合率显著提高，第11天创面闭合率达87.90%。免疫组织化学染色显示CD31阳性细胞数显著增加187.46%，Masson三色染色显示胶原沉积增加1.26倍，提示局部CSTA可加速糖尿病创面愈合并促进血管生成与胶原沉积。
2.7 卡泊三醇加速糖尿病小鼠创面愈合并促进血管生成和胶原沉积
研究人员评估了维生素D类似物卡泊三醇的治疗潜力，发现局部应用卡泊三醇可显著改善创面闭合，第9天创面闭合率达58.75%。与溶媒对照组相比，卡泊三醇组CD31阳性血管结构增加241.67%，胶原沉积增加1.37倍，表明该药物同样具有促进糖尿病创面修复的作用。
讨论部分，本研究的核心发现是糖尿病条件下CSTA表达的降低与受损的伤口修复相关，而外源性CSTA可增强真皮成纤维细胞和微血管内皮细胞的修复功能。这一发现填补了糖尿病创面研究中关于胶原沉积减少和血管生成降低等下游缺陷的上游表皮信号调控机制不明的空白。研究指出，CSTA作为内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其表达降低可能通过转录调控机制影响真皮修复。尽管既往研究表明Raf-1/MEK1/ERK信号通路可能调控角质形成细胞中CSTA的表达，但该通路是否介导游离高血糖诱导的CSTA抑制仍不清楚。此外，研究还探讨了组织蛋白酶K等半胱氨酸蛋白酶在慢性创面病理中的作用，提出CSTA作为内源性抑制剂的潜在治疗意义。然而，研究人员也承认本研究存在局限性：缺乏内源性CSTA缺失的功能丧失实验，RNA-seq发现的转录变化尚需验证具体信号通路，且小鼠创面模型不能完全模拟临床糖尿病足溃疡的复杂性，鼠模型以伤口收缩为主，而人类糖尿病足溃疡更依赖肉芽组织形成和再上皮化，因此观察到的创面闭合改善不能单独归因于再上皮化增强。
研究结论部分，本研究证实糖尿病条件下CSTA表达降低，并证明外源性重组CSTA对真皮修复相关细胞功能及伤口愈合具有有益作用。重组CSTA可增强成纤维细胞和内皮细胞的应答，局部给药可改善糖尿病小鼠的创面闭合、胶原沉积和CD31阳性血管结构。本研究的一个主要优势在于整合了转录组分析、细胞功能实验和动物实验，为CSTA参与真皮修复过程提供了互补性证据。尽管如此，若干局限性应予承认：缺乏功能丧失实验使得研究人员无法确立内源性CSTA缺乏是否因果性导致糖尿病创面愈合受损；此外，观察到的效应背后的分子通路仍有待功能验证，且小鼠创面模型无法完全重现人类糖尿病足溃疡的复杂性。
