四种基于重组酶辅助扩增（RAA）的禽腺病毒4型（FAdV-4）快速检测方法的建立、评价与应用

《International Journal of Molecular Sciences》：Four Recombinase-Aided Amplification Assays for the Rapid Detection of Fowl Adenovirus Serotype 4

　　

禽腺病毒4型（Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）感染对全球养禽业造成严重损害。准确而快速的诊断对于FAdV-4疫情的有效管控至关重要。在本研究中，研究人员首先基于FAdV-4毒株NP的开放阅读框19A（open reading frame 19A，ORF19A）基因设计了一对特异性引物，用于重组酶辅助扩增（recombinase-aided amplification，RAA），并对反应条件进行了优化。结果表明，高灵敏度RAA反应的最适条件为39 °C反应40 min。采用RAA时FAdV-4基因组的最低检测量为10^?2 ng/μL。为便于RAA检测结果的展示，研究人员利用侧向流动试纸条（lateral flow dipstick，LFD）对结果进行可视化判读，并将RAA-LFD的最适反应时间缩短至30 min。然而，RAA-LFD的最低可检测量为50 ng/μL，灵敏度低于RAA。为增强RAA-LFD的灵敏度，研究人员设计了LbaCas12a-FAdV-4-crRNA（CRISPR-derived RNA，CRISPR衍生RNA），并将其整合入RAA，分别建立了RAA-Cas12a-F和RAA-Cas12a-LFD方法。基于40 min的RAA反应，RAA-Cas12a-F与RAA-Cas12a-LFD仅需额外15 min。RAA-Cas12a-F和RAA-Cas12a-LFD的最低可检测量分别为10^?6 ng/μL和10^?5 ng/μL，表明两种检测方法的灵敏度均获得显著提升。研究人员共采集192份雏鸡粪便样本，并采用上述四种RAA快速检测方法进行检测。结果显示，RAA-Cas12a-F和RAA-Cas12a-LFD均筛选出57份阳性样本，较RAA方法多4份阳性样本，较RAA-LFD方法多14份阳性样本。总之，研究人员建立了四种准确、快速的FAdV-4 RAA检测方法，该方法在临床实践中具有可行性并具备一定应用价值。

禽腺病毒4型（FAdV-4）感染给全球禽类产业造成巨大经济损失，病毒可经水平与垂直途径传播，且从同一病鸟体内分离出多种FAdV血清型的情况十分常见，提示不同血清型之间缺乏交叉保护。FAdV依限制性内切酶消化与血清交叉中和试验可分为五个组（FAdV-A至FAdV-E）及12个血清型，各血清型在结构与基因组上差异显著，因而选择特异性基因作为核酸检测靶序列至关重要。目前尚无商业化疫苗可预防FAdV-4感染，因此建立快速、准确、灵敏且易于操作的检测技术，对及时控制病毒流行具有重要现实意义。传统鉴定方法操作要求较高的恒温设备，而环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）引物设计复杂、需4至6条引物、对操作环境要求苛刻，且无法通过克隆测序验证扩增产物。在此背景下，研究人员围绕FAdV-4检测开展系统研究。

为应对多血清型带来的检测挑战，研究人员比较了12种不同FAdV血清型的基因组，发现FAdV-4的ORF19A基因更为保守，遂以该基因为靶标设计特异性引物，建立了一系列RAA检测方法。研究用到的主要关键技术方法包括：通过多序列比对筛选并克隆FAdV-4保守的ORF19A靶基因；基于RAA等温扩增技术设计引物并系统优化反应温度与时间；引入侧向流动试纸条（LFD）建立可视化判读的RAA-LFD方法；针对RAA-LFD灵敏度不足的问题，设计LbaCas12a-crRNA并借助Cas12a的反式切割活性构建RAA-Cas12a-F荧光法与RAA-Cas12a-LFD试纸条法；临床样本队列为福建省龙岩市（68份）与漳州市（67份）规模化肉鸡场、南平市（57份）散养肉鸡的粪便样本，以及20份疑似FAdV-4感染病死鸡的肝脏样本，用于系统评价四种方法的检测性能。

研究结果如下。2.1节，RAA检测方法的建立与初步应用：通过琼脂糖凝胶电泳对9对引物进行筛选，选择条带最亮、特异性最佳的RAA-F9/R9为最优引物；37 °C至41 °C间扩增效率无显著差异，结合快速检测需求确定最适温度为39 °C；反应时间40 min与50 min条带均清晰，但50 min出现非特异性条带，故选40 min。灵敏度方面，RAA对病毒DNA的最低检测量为10^?2 ng/μL，对重组质粒为10³ copies/μL，均优于PCR；对新城疫病毒（NDV）、禽白血病病毒（ALV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、H9亚型禽流感病毒（AIVH9）及坦布苏病毒（TMUV）检测均为阴性，特异性良好；批内与批间重复性好；20份肝脏临床样本中11份阳性，与PCR符合率100%。2.2节，RAA-LFD方法的建立与初步应用：通过梯度优化将引物与探针浓度定为2.5 μM，以避免高浓度下的假阳性与低浓度下的假阴性；最适条件为39 °C反应30 min，较RAA缩短10 min；最低检测量为病毒DNA 50 ng/μL、重组质粒10³ copies/μL，灵敏度低于RAA与PCR，研究人员推测原因可能是商品化试条中抗体与胶体金标记试剂浓度固定，无法针对特定扩增产物优化；特异性良好，20份肝脏样本检出10份阳性（50%），与PCR阳性符合率90.9%。2.3节，CRISPR-Cas12a用于FAdV-4检测：确定最优crRNA浓度为300 nM，探针筛选中Fam-TTATT-Biotin条带最亮被选中；荧光法反应15 min即可观测明显荧光，试纸条法30 min判读。灵敏度大幅提升，RAA-Cas12a-F对病毒DNA最低检测量为10^?6 ng/μL、对质粒为10 copies/μL，RAA-Cas12a-LFD分别为10^?5 ng/μL与10² copies/μL，添加Cas蛋白后较RAA分别提高约10⁴倍与10³倍；对其他禽源病毒无交叉反应，20份肝脏样本检出11份阳性（55%），与RAA及PCR结果一致。2.4节，RAA相关方法检测临床样本：龙岩与漳州的135份规模化鸡场样本四种方法均为阴性（阳性率0%）；南平57份散养鸡粪便样本中，RAA与PCR均检出53份阳性，符合率100%；RAA-LFD检出43份阳性，符合率81.13%；RAA-Cas12a-F与RAA-Cas12a-LFD均检出57份阳性（100%），二者与PCR的阳性符合率均为92.98%，两种方法间符合率100%；三地区样本总阳性率为29.69%。

讨论部分，研究人员指出FAdV-4是家禽中主要流行血清型，RAA仅需约39 °C的小型恒温装置即可获得大量核酸片段，且重组酶来源于细菌或真菌、成本低于重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）；与LAMP相比，RAA允许直接对扩增产物测序验证，RAA-LFD可在30 min内完成恒温检测、无需温度循环设备，适合现场快速筛查，但受商品化试条试剂浓度限制，灵敏度欠佳。引入Cas12a后，crRNA对靶序列的特异性识别激活Cas12a的反式切割功能，使探针附近大量荧光基团释放，从而显著增强检测可视化程度与灵敏度。PAM设计方面，因扩增靶序列上游区域不含5′-TTTV-3′（V代表A/G/C）基序，故选择下游序列5′端3′-TTTA-3′作为原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM），结果表明LbaCas12a在下游PAM位点仍保持高效切割活性。研究亦存在不足：RAA-Cas12a需开盖转移产物，增加气溶胶污染风险；现有单管法虽可减少污染与反应时间，但灵敏度较低，可能与RAA中反应蛋白酶和Cas试剂的相互作用影响蛋白酶后期活性有关，有待通过调控试剂浓度加以解决；此外尚未结合无核酸提取方法，检测耗时较长。临床诊断中RAA与Cas12a蛋白结合的检出率最高，可能源于crRNA使核酸产物经指数级扩增后激活Cas12a切割活性，释放大量荧光基团。值得注意的是，规模化鸡场FAdV-4发病率远低于散养鸡场，表明规模化标准化养殖（涵盖疫苗防控与早期及时诊断）对家禽疫病防控具有重要意义。

研究结论部分翻译如下：本研究建立了四种不同的用于FAdV-4快速准确诊断的RAA方法。其中，FAdV-4的RAA-LFD方法灵敏度略低，但具备可视化、便捷与快速的优势；RAA-Cas12a-F和RAA-Cas12a-LFD则展现出更高的灵敏度与特异性。综上所述，这些方法可为FAdV-4的防控作出重要贡献。