《Cell Reports》：A competitive PDLIM1-USP14 axis destabilizes ACTN4 to disturb the invasive homeostasis of trophoblast in preeclampsia
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子痫前期（PE）以绒毛外滋养细胞（EVT）侵袭不足为特征，但限制EVT运动的细胞骨架机制尚不清楚。基于TMT的胎盘蛋白质组学鉴定出细胞骨架衔接蛋白PDLIM1在PE中显著上调。在原代滋养细胞和细胞系中，PDLIM1缺失重塑肌动蛋白细胞骨架并增强迁移和侵袭，而滋
子痫前期（PE）以绒毛外滋养细胞（EVT）侵袭不足为特征，但限制EVT运动的细胞骨架机制尚不清楚。基于TMT的胎盘蛋白质组学鉴定出细胞骨架衔接蛋白PDLIM1在PE中显著上调。在原代滋养细胞和细胞系中，PDLIM1缺失重塑肌动蛋白细胞骨架并增强迁移和侵袭，而滋养细胞限制性Pdlim1过表达损害小鼠滋养细胞侵袭和胎盘发育。机制上，PDLIM1结合α-辅肌动蛋白-4（ACTN4）的杆状结构域并竞争性置换USP14，限制ACTN4去泛素化并促使ACTN4向RNF38相关的K48连接泛素化和蛋白酶体周转偏移。重要的是，胎盘靶向的硫酸软骨素A结合纳米颗粒递送Pdlim1短发夹RNA（shRNA）缓解了小鼠PE样母体和胎儿表型。总之，这些发现定义了一个控制滋养细胞侵袭稳态的PDLIM1-USP14-ACTN4蛋白质稳态轴，并将PDLIM1确定为PE的潜在治疗靶点。
研究背景：子痫前期（preeclampsia，PE）是一种严重的妊娠并发症，以妊娠20周后新发高血压和蛋白尿为特征，与胎儿生长受限、围产期死亡及HELLP综合征（溶血、肝酶升高和血小板减少）等不良结局相关。胎盘功能障碍、螺旋动脉重塑缺陷及绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast，EVT）侵袭能力下降是PE发病机制的核心环节，其中EVT侵袭受损日益被认为是异常胎盘发育和疾病进展的关键驱动因素。然而，PE中EVT侵袭稳态紊乱的病理生理基础尚未完全阐明。侵袭能力降低的细胞常表现出细胞骨架组织和动力学异常。细胞骨架主要由肌动蛋白丝、微管和中间丝组成，其中肌动蛋白细胞骨架重塑是真核细胞的标志，对细胞运动、胞质分裂、膜运输和内吞等多种细胞过程至关重要。与血压正常妊娠相比，PE患者EVT中已记录到细胞骨架组织异常。研究人员此前的研究表明，滋养细胞α-辅肌动蛋白-4（α-actinin-4，ACTN4）在早发型PE胎盘中下调，且ACTN4缺陷小鼠表现出胎盘发育受损和PE样综合征。此外，依诺肝素通过恢复PE胎盘来源滋养细胞的细胞骨架纤维排列来改善PE样表现，提示细胞骨架重塑缺陷可能直接损害滋养细胞侵袭性，且这一病理联系具有潜在可逆性。PDLIM1属于PDZ/LIM家族肌动蛋白相关衔接蛋白，其成员将α-辅肌动蛋白及其他细胞骨架组分与信号复合物连接，从而调控肌动蛋白组织、细胞黏附、迁移和发育过程。尽管PDLIM2和PDLIM5等PDLIM家族成员在人胎盘滋养细胞中表达，但其对胎盘发育和妊娠疾病的具体贡献尚待探索，PDLIM1是否参与滋养细胞侵袭行为调控或PE发病机制尚未确立。
研究开展与结论：研究人员在本研究中证明PDLIM1在PE患者胎盘中显著上调并主要定位于滋养细胞。利用基因工程人滋养细胞模型，研究人员进一步表明PDLIM1缺失在体外和体内诱导细胞骨架重组并增强EVT侵袭能力。机制上，PDLIM1在人EVT中直接与ACTN4相互作用，并通过促进泛素介导的降解去稳定ACTN4，该过程涉及PDLIM1与去泛素化酶USP14竞争性结合ACTN4。此外，将包裹PDLIM1靶向短发夹RNA（shRNA）的纳米囊泡选择性递送至滋养细胞，可有效缓解小鼠模型中的PE样表型。总之，研究结果确定PDLIM1通过竞争性破坏USP14介导的ACTN4稳定化、促使ACTN4蛋白质稳态向降解偏移，从而作为EVT侵袭和迁移的负调控因子，并突出PDLIM1作为PE潜在治疗靶点的重要意义。
关键技术方法：研究人员采用基于串联质量标签（tandem mass tag，TMT）的定量蛋白质组学分析发现队列（4例血压正常对照和4例PE患者胎盘组织），并在扩展独立队列（53例血压正常对照和38例PE患者）中通过酶联免疫吸附试验（ELISA）验证血清候选蛋白；利用原代人心EVT、HTR8/SVneo、JEG3、JAR及HEK-293T细胞系进行体外功能实验；通过滋养细胞谱系靶向慢病毒转导去透明带小鼠囊胚实现滋养细胞限制性Pdlim1过表达并进行胚胎移植；采用CRISPR/Cas9介导的基因敲除、GST pull-down联合LC-MS/MS鉴定相互作用蛋白、免疫共沉淀（coIP）、泛素化实验及位点定向突变解析泛素化位点和连接类型；利用胎盘靶向硫酸软骨素A结合肽修饰纳米颗粒（plCSA-MNPs）递送shPdlim1，在L-NAME诱导的PE样小鼠模型中评估治疗效应。人胎盘和血清样本来源于重庆医科大学附属第一医院2019年4月至2022年7月收治的孕妇，早孕期绒毛和蜕膜组织（n=10）来源于6–10周因非医学原因合法终止妊娠的妇女。
研究结果：
PDLIM1蛋白在PE胎盘滋养细胞中升高：通过TMT定量蛋白质组学鉴定PE组42个上调和51个下调蛋白，GO富集分析突出肌动蛋白细胞骨架组织等8个主要生物学过程；聚焦细胞骨架相关差异表达蛋白鉴定出PDLIM1、ARHGEF18、CTTN上调及CDK5、PLEK下调；ELISA显示PE患者母体血清PDLIM1和CTTN水平显著升高，ROC曲线分析显示血清PDLIM1区分PE与血压正常妊娠的AUC为0.752；免疫组化和多重免疫组化证实PDLIM1主要定位于合体滋养细胞（STB）和EVT，PE胎盘染色强度显著增强且与CK7共定位，同时孕激素受体（PGR）表达降低；免疫印迹证实PE胎盘PDLIM1蛋白水平显著升高。由于血清样本在分娩时采集，当前数据未确立PDLIM1作为PE前瞻性预测因子。
Pdlim1在体内扰乱滋养细胞侵袭稳态：免疫荧光显示Pdlim1与滋养细胞标志物Ck8在D9.5、D11.5和D13.5胎盘组织中强共定位；去透明带小鼠囊胚转导GFP标记Pdlim1慢病毒实现滋养细胞谱系选择性过表达，GFP荧光限于D4.5外层滋养外胚层并持续限于D7.5植入胚胎滋养细胞；滋养细胞特异性Pdlim1过表达导致早期胎盘功能不全，D7.5和D9.5着床点数显著减少伴胚胎形态异常，D11.5和D13.5活胚胎数和胎盘重量显著降低；Ck8免疫染色显示Pdlim1过表达胎盘滋养细胞向胎盘基底膜侵袭明显受损，D11.5和D13.5交界区面积显著减少伴胎盘血窦形成减少；分子水平上Pdlim1过表达显著抑制MMP2、MMP9和Vimentin表达，同时上调E-cadherin及血管生成因子VEGFA和PLGF。
PDLIM1在体外抑制滋养细胞侵袭表型：siRNA和shRNA介导的原代EVT和JEG3细胞PDLIM1沉默上调MMP9、MMP2和vimentin并增强迁移和侵袭能力；JAR细胞PDLIM1过表达抑制间充质标志物和基质金属蛋白酶表达并降低细胞运动和侵袭；CRISPR/Cas9介导的HTR8/SVneo细胞PDLIM1敲除上调MMP2、MMP9和Vimentin，增强迁移侵袭行为和划痕愈合，并激活黏着斑信号（FAK Tyr397磷酸化增加及迁移前沿富集）；RNA-seq显示PDLIM1敲除细胞迁移、肌动蛋白细胞骨架组织、黏附连接等基因签名富集，GO和KEGG分析显示蛋白酶体、泛素介导的蛋白水解和自噬等通路显著改变；GSEA网络分析表明PDLIM1调控非整合素膜-ECM相互作用、Sema4D驱动细胞迁移、TGFβ-Smad信号等广泛生物学程序。
PDLIM1通过与ACTN4物理相互作用抑制细胞运动和侵袭：GST pull-down联合LC-MS/MS鉴定HS90A、ACTN4、BIP、HSP7C和EF2为PDLIM1候选相互作用蛋白；GST pull-down、免疫荧光和免疫组化证实PDLIM1与ACTN4在组织和细胞水平胞质共定位，coIP验证内源性和外源性复合物；结构域定位显示PDLIM1中间结构域（Middle）介导与ACTN4结合，ACTN4杆状结构域（RD）为相互作用所必需；ACTN4敲低消除PDLIM1缺失诱导的EMT标志物和MMP2/MMP9上调，ACTN4回补恢复PDLIM1过表达抑制的EMT标志物表达及迁移侵袭能力，ACTN4沉默消除PDLIM1缺失诱导的侵袭性生长。
PDLIM1促进泛素化ACTN4的积累：免疫组化和免疫印迹显示PE胎盘PDLIM1高表达伴ACTN4降低，正常胎盘则相反；PDLIM1沉默增加ACTN4蛋白丰度而不改变mRNA水平，过表达降低ACTN4蛋白水平而不影响转录本丰度；MG132挽救PDLIM1过表达诱导的ACTN4蛋白减少，而巴弗洛霉素A1无影响；CHX追踪实验显示PDLIM1缺失减缓ACTN4降解，过表达加速ACTN4周转；泛素化实验显示PDLIM1缺失降低内源性ACTN4泛素化，过表达以剂量依赖性增强ACTN4泛素化，仅全长PDLIM1和中间结构域促进ACTN4泛素化；质谱鉴定9个候选泛素化赖氨酸残基，位点定向突变显示K140、K166、K217或K622突变为精氨酸导致ACTN4蛋白显著积累；赖氨酸唯一泛素突变体实验显示K48唯一泛素诱导最强的ACTN4多泛素化信号。
PDLIM1与USP14竞争结合ACTN4：ACTN4免疫共沉淀联合银染和LC-MS/MS鉴定3个候选E3连接酶和4个去泛素化酶；验证ACTN4与USP14和TRIM21特异性相互作用，TRIM21过表达不进一步增强ACTN4多泛素化；RNF38与ACTN4特异性关联，RNF38敲低降低基础K48连接ACTN4多泛素化并部分减弱PDLIM1相关ACTN4泛素化增加、部分恢复ACTN4蛋白丰度；USP14敲低显著降低ACTN4蛋白丰度而不影响PDLIM1水平，Myc-USP14过表达显著增加ACTN4蛋白水平；分子对接预测USP14残基S168、D161和R141参与ACTN4结合界面，GST pull-down证实USP14直接结合ACTN4但不与PDLIM1相互作用；结构域定位显示USP14通过ACTN4杆状结构域结合，与PDLIM1结合区域相同；递增剂量PDLIM1逐渐减弱USP14-ACTN4相互作用，免疫荧光证实PDLIM1过表达降低ACTN4与USP14胞质共定位；野生型USP14而非结合缺陷突变体降低ACTN4泛素化并损害PDLIM1-ACTN4关联；USP14敲除细胞中PDLIM1过表达或沉默均不改变ACTN4蛋白丰度和泛素化状态，PDLIM1失调对细胞运动和侵袭性的影响在USP14缺失或活性抑制时完全消除；ACTN4-ΔRD突变体在任何条件下均未检测到泛素化变化。
胎盘靶向递送shRNA-Pdlim1纳米颗粒缓解早期妊娠PE样表型：将靶向Pdlim1的shRNA封装入plCSA-MNPs，D7.5和D12.0静脉给药孕鼠；透射电镜显示纳米颗粒均匀球形形态，理化表征显示对照和shPdlim1负载制剂粒径（347.8±4.6 nm vs. 368.9±8.8 nm）、PDI（0.10±0.03 vs. 0.15±0.07）、zeta电位（?14.2±1.7 mV vs. ?11.4±0.6 mV）和包封效率（62.42±6.31% vs. 57.54±4.31%）相当；体内荧光成像显示注射后1小时胎盘组织强烈蓄积且其他主要器官分布极少，免疫荧光证实D17.5胎盘CK8+ EVT有效内化纳米颗粒；L-NAME诱导PE样小鼠模型中，plCSA-MNPs-shPdlim1显著降低收缩压、降低循环sFLT1水平和尿白蛋白排泄、减轻肾脏病理损伤、恢复迷宫区/交界区比值、改善胎盘重量、胎儿重量和胎儿长度；胎盘组织Pdlim1 mRNA和蛋白特异性持续沉默，其他器官无可检测变化，主要器官组织学检查无明显结构异常；对照纳米颗粒制剂对母体或胎盘生理参数无显著影响。
讨论部分总结：研究人员识别出PE胎盘组织显著的细胞骨架重组伴PDLIM1上调，PDLIM1作为非酶性支架蛋白其功能输出取决于特定细胞环境中相互作用伴侣的丰度、亚细胞定位和化学计量平衡；在滋养细胞中ACTN4和USP14构成上下文特异性调控模块，PDLIM1升高竞争性置换USP14与ACTN4结合，减少ACTN4去泛素化并促使其蛋白质稳态向泛素化和蛋白酶体周转偏移，导致ACTN4丰度降低从而限制滋养细胞运动和侵袭。研究人员首次 delineate PDLIM1相互作用所需的ACTN4特异性结构域，PDLIM1通过翻译后而非转录调控ACTN4侵袭性，ACTN4多泛素化多个赖氨酸残基加速蛋白周转；滋养细胞数据鉴定K48连接多泛素化为主要ACTN4链拓扑及K140、K166、K217和K622为ACTN4周转主要决定因素，与骨肉瘤中K63连接机制涉及K66不同，提示ACTN4蛋白质稳态由细胞类型特异性泛素密码调控。由于PDLIM1缺乏内在E3泛素连接酶活性，其对ACTN4泛素化的影响应解释为间接效应，数据支持ACTN4经RNF38相关泛素化而USP14通过去泛素化拮抗该过程并稳定ACTN4的模型；RNF38敲低的部分效应提示其他ACTN4定向E3连接酶可能参与。研究还提示PDLIM1-USP14-ACTN4轴可能影响生殖免疫微环境，PDLIM1通过ACTN4依赖机制将p65亚基滞留于胞质抑制NF-κB信号，提供PDLIM1-ACTN4相互作用与炎症信号之间的潜在分子联系。循环PDLIM1以中等判别性能区分PE与血压正常妊娠，但血清样本在分娩时采集，阻碍前瞻性预测价值评估，应视为候选PE相关生物标志物而非临床验证的预测因子。纳米技术递送系统在效率、成本和时间控制方面具有优势，胎盘靶向递送shRNA有效恢复滋养细胞侵袭、改善胎盘结构并缓解PE样母体和胎儿表型而无明显全身毒性，局部干预规避了全球抑制泛素-蛋白酶体组分的风险。研究局限性包括：RNF38敲低仅部分减弱PDLIM1相关效应提示其他E3连接酶或泛素编辑酶可能参与ACTN4周转；循环PDLIM1在分娩时血清样本中评估，前瞻性预测价值尚待独立纵向队列验证；胎盘靶向Pdlim1沉默虽缓解小鼠PE样表型，但其长期母胎安全性、最佳治疗窗口和转化可行性需进一步研究；当前滋养细胞和小鼠模型无法完全再现人PE的异质性和复杂性。
研究结论翻译：总之，本研究鉴定了一种此前未认识的分子机制，即滋养细胞特异性PDLIM1失调通过竞争性控制USP14依赖性ACTN4泛素化抑制滋养细胞侵袭。通过将细胞骨架衔接蛋白与泛素介导的蛋白质稳态和胎盘功能障碍相联系，研究人员为PE发病机制提供了新见解，并将PDLIM1定位为细胞骨架稳态的分子守门人和有前景的治疗靶点。这些发现为旨在恢复PE胎盘侵袭能力的精准干预开辟了新途径。
