半胱氨酸通过限制电压门控钠通道（NaV）氧化抑制促进胰岛α细胞胰高血糖素分泌

《Cell Reports》：Cysteine promotes islet α-cell glucagon secretion by limiting oxidative inhibition of voltage-gated sodium channels

　　

半胱氨酸是一种强效的α细胞（α-cell）促分泌剂（secretagogue，促进激素分泌的物质）。虽然糖尿病（diabetes）会同时改变血浆半胱氨酸（cysteine, Cys）与胰高血糖素水平，但Cys在α细胞中的作用机制仍不清楚。研究人员确定，Cys是通过氧化还原控制（redox control）α细胞电兴奋性（electrical excitability，细胞产生电信号的能力）来调控胰岛胰高血糖素分泌（islet glucagon secretion）的关键因子。短期Cys耗竭显著抑制人和小鼠胰岛的低血糖（hypoglycemia）刺激胰高血糖素分泌。此外，Cys耗竭的胰岛显示低血糖刺激的α细胞钙离子（calcium, Ca²⁺）内流减少；在Cys恢复后，胰岛胰高血糖素分泌和α细胞Ca²⁺内流迅速恢复正常。Cys耗竭还降低了α细胞电压门控钠通道（voltage-gated sodium channel, NaV）电导和动作电位（action potential, AP）幅度。重要的是，还原剂（reducing agents）恢复了无Cys胰岛中NaV电流及α细胞Ca²⁺处理的葡萄糖调控。综上所述，这些发现确定NaV通道的还原性放大（reductive amplification，还原环境增强通道活性）是低血糖刺激胰高血糖素分泌所需的关键机制，并强调Cys是α细胞氧化还原状态、电兴奋性和胰高血糖素分泌的关键调节因子。

研究背景与问题

胰岛α细胞（α-cell）对维持血糖与氨基酸稳态不可或缺。与β细胞相比，α细胞糖酵解更强、氧化磷酸化较弱，但脂肪酸以及丙氨酸、谷氨酰胺等氨基酸（amino acid, AA）可刺激其氧化磷酸化并产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），提示营养可用性可能直接调控α细胞还原-氧化（reduction-oxidation, redox）信号。α细胞因高表达抗氧化酶（如可降解过氧化氢的过氧化氢酶）并以谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸（cysteine, Cys）为原料合成还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）而对氧化应激具有较强抵抗力，其中Cys是关键限速成分；Cys代谢为硫化氢（hydrogen sulfide, H₂S）的过程亦可清除ROS并经半胱氨酸残基的过硫化（persulfidation，蛋白质的硫化修饰）可逆修饰氧化还原敏感蛋白。尽管氧化还原控制离子通道门控与电导的机制已在β细胞中确立，α细胞中是否存在类似回路仍不清楚；且糖尿病会同时改变血浆Cys与胰高血糖素水平，其关联机制未知，这是本研究的核心问题。

研究人员开展的研究与意义

研究人员以C57BL/6J背景工具鼠（经Gcg^Cre与Rosa26位点loxP-STOP-loxP报告基因杂交实现α细胞特异性表达GCaMP3钙指示剂或Salsa6f比率钙指示剂）及经整合胰岛分配计划（integrated islet distribution program, IIDP）获取的4例（2男2女、34–63岁）供体胰岛为材料，结合灌流动态分泌实验、活细胞成像与膜片钳电生理技术，确定Cys通过还原性放大NaV通道、限制其氧化抑制，从而维持低血糖诱导的Ca²⁺内流与胰高血糖素分泌。该发现将α细胞氧化还原状态、电兴奋性、Ca²⁺内流与胰高血糖素分泌串联为完整机制链，为理解糖尿病中反调节（counter-regulation，机体对低血糖的代偿反应）缺陷提供了潜在细胞机制。

关键技术与方法

主要方法包括：胰岛灌流（perifusion，动态灌流流检测激素分泌）实验测定胰高血糖素分泌；基于GCaMP3的α细胞[Ca²⁺]_i共聚焦成像；基于pEpac-SH187探针的cAMP FRET（荧光共振能量转移）成像；膜片钳电生理（穿孔膜片钳在细胞膜打孔记录膜电位与K_ATP电流、全细胞膜片钳记录全细胞NaV与Ca_V电流）。样本为C57BL/6J小鼠胰岛及IIDP提供的4例人类供体胰岛。

研究结果

半胱氨酸是驱动α细胞胰高血糖素分泌的关键因素。小鼠胰岛在缺失Cys/甲硫氨酸培养基预培养4小时后，Cys耗竭在11 mM高血糖与1 mM低血糖下均显著降低胰高血糖素分泌，精氨酸（arginine, Arg）刺激的分泌亦受损，而KCl诱导的分泌不受影响；补充2 mM Cys可立即恢复分泌，耗竭后恢复的分泌倍数变化大于对照，且胰岛总胰高血糖素含量无差异。D-Cys（不进入L-Cys分解代谢途径）抑制对照胰岛分泌，表明L-Cys分解代谢为放大分泌所必需；抑制α细胞最丰富的Cys转运体SLC7A11可阻断L-Cys对耗竭胰岛分泌的恢复，说明SLC7A11介导的Cys摄取是低血糖条件下Cys调控葡萄糖感知的关键。人类胰岛中Cys耗竭同样阻断低血糖刺激的分泌并削弱高血糖基础分泌，Arg与KCl刺激的分泌亦显著下降。

半胱氨酸在不改变cAMP的情况下促进低血糖诱导的α细胞Ca²⁺内流。高转低葡萄糖使对照胰岛α细胞[Ca²⁺]_i增加约2.01倍，Cys耗竭消除该反应，而KCl去极化及Arg、肾上腺素（epinephrine, Epi）刺激的Ca²⁺内流在两组间相当，说明Cys信号特异性地为低糖条件下Ca²⁺进入所必需。cAMP水平在高糖、低糖及Epi刺激下均不受Cys影响，表明Cys不作用于cAMP信号。

半胱氨酸使α细胞膜电位去极化并增加动作电位幅度与NaV电导。补充2 mM Cys在10分钟内使86%无Cys培养的α细胞去极化；0.2 mM Cys仅抑制非生理性超极化电压下的K_ATP电流。Tolbutamide诱导去极化后仅50%的α细胞持续动作电位（action potential, AP）放电，加2 mM Cys后90%恢复且平台电位不变。全细胞记录显示Cys耗竭轻度减小Ca_V电流，并显著减小NaV电流（小鼠与人类α细胞一致），且NaV调节发生于生理电压范围，提示其可能发挥更突出作用。

半胱氨酸通过限制氧化抑制增强α细胞NaV电导与Ca²⁺内流。Cys补充增加无Cys培养α细胞的Ca²⁺内流，但仅超生理浓度2 mM Cys对含生理Cys的α细胞有效。H₂S生成中间物3-巯基丙酮酸（3-mercaptopyruvate, 3-MP）增强低血糖刺激的Ca²⁺内流与全细胞NaV电流；电极内加入还原剂二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）同样恢复NaV活性，证明NaV通道受氧化还原依赖机制调节。

讨论与结论

讨论指出，Cys代谢是α细胞葡萄糖依赖的电兴奋性、NaV激活、Ca²⁺进入与胰高血糖素分泌的关键决定因素；α细胞高表达CBS、GCLC、GCLM、MPST、CSAD、CDO1等Cys代谢酶。Cys仅在非生理超极化电压（低于?110 mV）下轻度抑制K_ATP电流，其诱导的去极化可能是K_ATP非依赖性的。NaV通道含多个氧化还原敏感半胱氨酸残基，可发生S-亚硝基化、S-过硫化及潜在的S-谷胱甘肽化（S-glutathionylation）修饰，从而调节其门控与膜定位；药理学与遗传学破坏NaV功能均抑制胰高血糖素分泌。Cys依赖的NaV放大与AP幅度增加预计促进经P/Q型Ca_V通道（邻近胰高血糖素颗粒）的Ca²⁺内流，这解释了Arg与KCl去极化后Ca²⁺内流相当而Cys耗竭胰岛分泌仍减少的矛盾现象。临床方面，1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）患者Cys/GSH稳态破坏、糖尿病Zucker大鼠循环Cys与GSH降低、高糖暴露降低培养细胞内Cys与GSH，而Cys供体N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）可保护反复低血糖后的反调节胰高血糖素反应。研究同时指出局限：尚缺乏NaV通道氧化还原敏感二硫键的直接证据，Cys是否升高α细胞H₂S与还原当量尚待阐明，GSH与H₂S的贡献亦无法选择性区分。

研究结论：葡萄糖对胰高血糖素分泌的调控依赖Cys产生的还原当量，在低血糖条件下激活NaV通道；未来需确定慢性高血糖或氧化应激下该Cys-氧化还原-NaV通路是否经氧化修饰抑制NaV而发生改变，维持Cys依赖的氧化还原稳态可能有助于恢复糖尿病中的胰高血糖素分泌。