《Plants》：Integrative GWAS and RNA-Seq Analysis Prioritizes a Major Chromosome 4H Locus and Candidate Genes for Barley Leaf Length
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叶长是大麦株型结构的重要性状，但其遗传基础尚未完全阐明。本研究整合全基因组关联分析（GWAS）、转录组测序（RNA-seq）及序列变异分析，探究大麦叶长变异的遗传与转录基础。研究人员对198份大麦材料在兩個生长季进行表型评价，并对叶长极端差异材料开展RNA-s
叶长是大麦株型结构的重要性状，但其遗传基础尚未完全阐明。本研究整合全基因组关联分析（GWAS）、转录组测序（RNA-seq）及序列变异分析，探究大麦叶长变异的遗传与转录基础。研究人员对198份大麦材料在兩個生长季进行表型评价，并对叶长极端差异材料开展RNA-seq。GWAS在第4H染色体上鉴定到一个主效关联信号，经局部连锁不平衡（LD）分析界定核心区间约为941.73 kb。RNA-seq分别在旗叶（FL）和倒二叶（SL）中鉴定到3507个和3878个差异表达基因（DEGs），其中2648个为共享DEGs。功能富集与基因集富集分析表明，发育、信号传导、代谢及温度响应等过程存在差异。整合GWAS与RNA-seq数据优先获得三个候选基因LOC123447426、LOC123449930和LOC123450878，其支持证据水平不同。LOC123447426与LOC123450878位于核心关联区间内，而LOC123449930位于扩展候选筛选区域，距领先SNP约2.2 Mb。LOC123447426具有最强的整合支持证据，其依据来自GWAS及两个叶位的差异表达。序列变异与qRT-PCR分析为上述候选基因提供了进一步支持。总体而言，本研究优先定位了大麦叶长变异相关的主效第4H染色体区域及三个候选基因，为其在叶片发育中潜在作用的深入研究提供了基础。然而，当前证据尚未确立这些基因与叶长变异之间的因果关系，其生物学功能仍有待实验验证。
**研究背景与科学问题**
大麦（Hordeum vulgare L.）是全球主要谷类作物之一，广泛用于饲料、制麦酿造及食品生产。其二倍体基因组、丰富的遗传多样性及完善的遗传资源使其成为小麦族（Triticeae）遗传与基因组研究的重要模式植物。叶片结构影响光截获、光合效率、冠层结构及生物量积累，大麦在叶长、叶宽、叶角及叶厚等叶形态方面存在丰富的遗传变异。叶长作为叶片大小与冠层结构的重要组成部分，由细胞增殖与扩展等发育过程以及叶片伸长的时序与速率决定。已有研究报道了PHOTOPERIOD-H1（Ppd-H1）、NARROW LEAFED DWARF1（NLD1）、BROAD LEAF1及HvWOX3A等基因与叶片发育相关，多项数量性状位点（QTL）研究也定位了与旗叶形态、叶长和叶面积相关的基因组区域。然而，大麦叶长自然变异的遗传基础仍不完全清楚，其背后的转录过程亦需进一步研究。
GWAS通过利用历史重组和自然遗传变异研究复杂数量性状，但通常鉴定的是关联基因组区域而非因果基因，因此需要互补的分子证据进行候选基因优先排序。RNA-seq可通过鉴定差异表达基因（DEGs）并提供与对比表型相关的转录响应证据。整合GWAS与转录组数据能够结合位置与表达证据以缩小候选基因区域。序列变异分析可进一步鉴定可能贡献表型差异的自然SNP和InDel，这对于等位变异丰富的大麦种质尤为重要。基于此，研究人员假设大麦叶长的自然变异与遗传位点及基因表达差异相关，整合GWAS与转录组证据有助于优先筛选与该性状相关的候选基因。
**主要关键技术方法**
研究人员构建了由198份大麦材料组成的关联群体，于2021年和2022年两个生长季在河南田间进行叶长与叶宽表型评价，采用随机完全区组设计，于抽穗期测量旗叶叶长与叶宽。基因型数据通过双酶切限制性位点关联DNA测序（ddRAD-seq）在Illumina NovaSeq平台产生，采用EMMAX混合线性模型进行GWAS，显著性阈值设为?log10(P) = 6。围绕主效信号利用PopLDdecay进行连锁不平衡（LD）分析并以500 kb窗口界定候选区间。选取叶长极端差异材料D64与D360的旗叶（FL）和倒二叶（SL）各三个生物学重复进行RNA-seq，经HISAT2比对至Morex v3参考基因组、DESeq2鉴定DEGs。开展GO与KEGG富集及基因集富集分析（GSEA），并进行转录因子（TF）、可变剪接（AS）及蛋白–蛋白互作（PPI）预测分析。整合GWAS区间基因与DEGs优先候选基因，并从同一198份群体中选取30份长叶与30份短叶材料进行候选基因序列变异分析，以qRT-PCR验证表达。
**研究结果**
2.1 大麦群体叶长表型变异：对198份材料连续两年评价叶长（LL）与叶宽（LW），叶长在两个年份均呈现丰富的表型变异，2021年均值为18.35 cm（变异系数17.77%），2022年均值为14.85 cm（变异系数22.30%），频率分布近似正态。叶宽亦呈连续变异。通过比较筛选出叶长显著差异的长叶材料D64（19.29 ± 0.90 cm）与短叶材料D360（13.44 ± 0.70 cm）（p < 0.01），两者在株高、每穗实粒数及千粒重等性状上亦存在显著差异，确认其为后续转录组分析的对比材料。
2.2 全基因组关联与连锁不平衡分析鉴定大麦主效叶长位点：GWAS在多个染色体上检测到显著标记–性状关联，其中最强信号位于第4H染色体，领先SNP位于Chr4H: 596,652,626。Q–Q图整体拟合良好且无明显系统性膨胀。区域关联分析显示最强信号位于596.157–597.099 Mb区间，对应约941.73 kb的核心区间，邻近SNP亦显示升高信号，LD分析显示该区域存在明显的连锁不平衡结构。将区域扩展至约596–599 Mb进行初步候选筛选，共鉴定到30个注释基因，包括编码五肽重复蛋白、细胞数目调节因子2、生长素诱导蛋白5NG4、类枯草杆菌蛋白酶SBT1.2、类钙调蛋白CML16、KNUCKLES等基因，其中LOC123450878与LOC123447426位于主效关联区域内，LOC123449902位于领先SNP下游约9.2 kb。
2.3 对比叶长基因型的差异表达与表达模式分析：对D64与D360的旗叶和倒二叶进行RNA-seq，各样本清洁读数为37.68–48.10百万条，总比对率96.11%–96.90%，Q30值95.80%–96.25%。生物学重复间相关系数为0.92–1.00，主成分分析（PCA）显示前两个主成分累计解释98.9%的变异，样本按材料和叶位聚类。在旗叶比较中鉴定到3507个DEGs（1579个上调、1928个下调），在倒二叶比较中鉴定到3878个DEGs（1830个上调、2048个下调）。DEGs分布于全部七条染色体。层次聚类显示D64与D360清晰分离，趋势分析将DEGs划分为G-C1至G-C9九个表达模式簇，其中G-C1至G-C3在D360中表达较高，G-C4至G-C6在D64中表达较高。两个叶位共享2648个DEGs，其余为叶位特异DEGs，共享DEGs用于后续功能富集分析。
2.4 差异表达基因的功能富集分析：GO富集分析显示，旗叶比较中富集到蛋白磷酸化、磷酸化、对生物刺激响应、对外部刺激响应、蛋白激酶活性、核苷酸结合及膜相关条目；倒二叶比较中富集到蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、核苷酸结合、磷酸化、对生物刺激响应、对外部刺激响应及质膜相关条目，两个叶位共享磷酸化相关、核苷酸结合及生物/外部刺激响应等类别。KEGG富集显示旗叶中富集到淀粉与蔗糖代谢、甘油磷脂代谢、谷胱甘肽代谢及氮代谢通路，倒二叶中富集到淀粉与蔗糖代谢、甘油磷脂代谢、脂肪酸降解及氮代谢通路，其中淀粉与蔗糖代谢、甘油磷脂代谢及氮代谢在两个叶位均富集。GSEA显示"对温度刺激响应"基因集在倒二叶比较中呈显著负富集（标准化富集分数NES为?2.07，校正p值 < 0.001），该基因集成员主要分布于排序列表的D360_SL端；同一基因集在旗叶中NES为?1.62，名义p值 < 0.01但校正p值 > 0.5，仅在倒二叶比较中经多重检验校正后显著。KEGG核糖体基因集在两个叶位经校正后均未显著富集。
2.5 转录因子分析揭示与叶长变异相关的潜在调控特征：在兩個叶位的DEGs中鉴定到多个转录因子家族，包括bHLH、C2H2、NAC、B3、MYB、AP2/ERF、WRKY及MADS-box等，其组成在两个叶位间存在差异：旗叶中主要为bHLH、C2H2、NAC和B3，倒二叶中主要为MYB相关、bHLH、C2H2、B3和HD-ZIP家族，两个叶位均检测到上调和下调转录因子。可变剪接分析检测到可变3′剪接位点（A3SS）、可变5′剪接位点（A5SS）、外显子跳跃（SE）、内含子保留（RI）及互斥外显子（MXE）五类事件，SE在两个叶位中均为最丰富的类型，其次为A3SS和A5SS，已知与新颖剪接事件均有检出，其数量与分布在D64与D360间及两个叶位间存在差异。基于DEGs编码蛋白构建的PPI预测网络在两个叶位间呈现不同互作模式，部分基因处于网络相对中心位置并具有多个预测互作，这些互作属计算预测，尚需实验验证。
2.6 整合GWAS与RNA-seq鉴定大麦叶长相关候选基因：将扩展候选筛选区域内的30个注释基因与旗叶和倒二叶DEGs进行比较，鉴定到三个同时受GWAS与转录组证据支持的基因。LOC123450878位于GWAS区域且在旗叶中差异表达；LOC123449930位于GWAS候选筛选区域且在倒二叶中差异表达；LOC123447426位于GWAS区域且在旗叶和倒二叶中均差异表达。其中LOC123447426因在两个叶位均差异表达而具有最强的转录组支持，三个基因的支持强度与叶位特异性存在差异，被选入后续序列变异与表达分析。
2.7 优先候选基因的自然序列变异与表达分析：选取包括30份长叶和30份短叶材料的60份大麦材料进行候选基因测序，在三个基因中均鉴定到多个自然多态性：LOC123447426分析区域检测到多个SNP；LOC123449930检测到多个SNP，包括编码区内的多态性；LOC123450878检测到SNP和InDel，包括起始密码子附近及编码区内的变异。qRT-PCR分析显示三个基因在D64的旗叶和倒二叶中表达量均显著高于D360：旗叶中LOC123447426、LOC123449930和LOC123450878在D64中的相对表达量分别为0.59、0.79和0.72，在D360中分别为0.02、0.05和0.01；倒二叶中相应表达量在D64中分别为0.61、0.94和0.44，在D360中分别为0.02、0.10和0.01，差异均显著。qRT-PCR结果与RNA-seq表达模式一致，结合其GWAS区域位置及对比材料间的差异表达，为三个基因作为大麦叶长自然变异候选基因提供了额外证据。
**讨论与结论**
讨论部分首先指出，198份材料两个生长季的表型变异、连续分布及较高变异系数支持叶长的数量性状特征，与既往关于大麦叶大小受遗传与环境影响的报道一致；但表型变异本身无法区分遗传效应与环境影响，凸显了整合遗传与转录组分析的必要性。本研究GWAS在第4H染色体约596.65 Mb处鉴定到主效信号，局部LD分析界定约941.73 kb的核心区间，为叶长变异遗传基础研究提供了基因组区域，并补充了既往报道的叶长及相关性状位点。D64与D360的表型对比为转录组分析提供了基础，但两者在其他农艺性状上亦存在差异，所观察到的转录差异可能反映遗传背景、发育状态或生理性状的差异，而非仅由叶长决定。
关于转录组差异，研究表明两个叶位共享大量DEGs提示对比叶表型伴随跨叶位的共同转录差异，而叶位特异DEGs提示部分转录响应可能依赖发育或生理背景；由于两材料在其他农艺性状上存在差异，这些转录差异不能特异归因于叶长变异。叶大小由细胞增殖与扩展的协调调控决定，禾本科叶片生长涉及基部生长区细胞的持续产生与扩展，本研究中磷酸化与蛋白激酶相关功能的富集与长、短叶材料间信号活性差异相符，但富集模式本身不能证明这些信号过程直接决定大麦叶长。淀粉与蔗糖代谢及甘油磷脂相关代谢功能的富集提供了两材料间生理差异的信息，转录组数据支持叶长变异与发育信号及细胞代谢的协调差异相关的模型，但哪些过程与观察到的叶长差异直接相关仍需进一步生理与细胞分析。
关于环境响应与调控特征，GSEA结果为常规DEG富集分析提供了额外信息，"对温度刺激响应"基因集在D64_SL相对D360_SL中呈显著负富集，而同一基因集在旗叶中方向相似但经多重检验校正后不显著，提示环境响应相关转录可能随发育背景而异；温度是影响植物发育的重要环境因子，但当前实验无法确定温度响应基因是否直接贡献叶长自然变异，该GSEA结果应视为分子背景而非温度介导叶长机制的直接证据。转录因子分析揭示多个家族在DEG集中富集，提示转录调控可能参与两材料间的分子差异，但TF富集本身不能鉴定直接的TF–靶标关系。可变剪接分析检测到多类剪接事件，提示转录本异构体多样性伴随两材料间的转录差异，但当前分析未确定任何单个剪接变异是否贡献叶长变异；PPI预测网络提供关于DEGs功能关系的假设，不应解释为实验证实的互作。
关于整合分析优先的三个候选基因，研究表明GWAS可鉴定关联区域但区间内基因数较多使候选筛选具有挑战性，转录组信息通过鉴定对比表型间差异表达基因提供独立证据层，但此类表达差异也可能反映所选材料间的遗传背景、发育或生理差异，不应解释为叶长特异效应的直接证据。LOC123447426在两个叶位均一致差异表达，其预测的KNUCKLES类注释提供了额外功能线索，KNUCKLES相关基因在拟南芥中与分生组织活性及发育过程调控相关，鉴于叶片生长依赖细胞增殖与扩展的协调，该注释与叶生长相关发育过程中的潜在作用相符，但大麦候选基因与拟南芥同源基因的功能相似性仍待实验确立，目前应视为高优先级候选基因而非该性状的确证调控因子。LOC123450878受GWAS信号及旗叶差异表达支持，其细胞数目调节因子注释具有生物学相关性，既往大麦研究显示叶大小遗传变异可与叶生长及细胞特征差异相关，玉米中CELL NUMBER REGULATOR1影响植株与器官大小，但其在大麦叶片发育中的作用仍缺乏直接实验证据。LOC123449930受GWAS信号及倒二叶差异表达支持，注释为呼吸爆发氧化酶类似蛋白B1，提示与细胞氧化还原相关过程可能的联系，但当前数据未直接证明其与活性氧及叶生长的关系。序列变异与表达分析为三个基因提供了额外支持，多种证据的汇聚增强了优先排序，但这些数据处于不同生物学水平，不应视为等价的因果证据，功能验证仍是确定特定变异或等位基因是否直接贡献叶长变异所必需的。三个基因证据水平的差异为后续功能研究提供了依据：LOC123447426为最高优先级验证候选，另两个基因代表可能通过不同生物学过程贡献叶长变异的补充候选。总体而言，综合证据支持三个基因作为大麦叶长自然变异的推定候选基因，其中LOC123447426获得最强支持，为后续功能表征与遗传验证提供了聚焦的靶标集合。
局限性方面，研究指出GWAS鉴定的是统计关联而非因果基因或因果变异，需要在4H区间内通过精细定位和更大遗传群体确定因果基因组变异；转录组分析基于D64与D360对比材料，所观察的表达模式应在更广泛的大麦材料和发育阶段中验证，且由于两材料在其他农艺性状上存在差异，转录差异不能仅归因于叶长变异；三个候选基因中鉴定的序列变异可能包含连锁或非因果多态性，启动子活性分析、等位基因特异表达分析及定向诱变有助于区分功能变异与连锁多态性。TF、可变剪接及PPI分析产生的调控信息亦需实验验证，候选TF–靶标关系可采用酵母单杂交、双荧光素酶报告或基于染色质的方法检验，推定蛋白互作可采用酵母双杂交、共免疫沉淀或双分子荧光互补检验，最重要的是需要CRISPR/Cas介导的基因编辑、过表达或互补实验确定三个候选基因是否影响大麦叶长，细胞表型分析可进一步阐明候选基因是否与细胞数目、细胞大小或叶生长持续时间的变化相关。
结论部分译为：本研究整合表型评价、GWAS、RNA-seq及序列变异分析，探究大麦叶长变异的遗传基础。鉴定到第4H染色体上的主效关联区域，经局部连锁不平衡分析界定核心区间约941.73 kb。转录组分析揭示对比材料在旗叶和倒二叶中广泛的基因表达差异，为叶长变异提供了额外分子证据。整合GWAS与RNA-seq结果优先获得三个候选基因LOC123447426、LOC123449930和LOC123450878，其支持证据水平不同。LOC123447426具有最强的整合支持，位于核心关联区间内且在两个叶位均差异表达；LOC123450878亦位于核心区间内且在旗叶中差异表达；相比之下，LOC123449930位于扩展候选筛选区域，距领先SNP约2.2 Mb，支持相对较弱。序列变异与qRT-PCR分析为这些候选基因与叶长变异的潜在关联提供了额外证据。然而，当前发现尚未确立这些基因与叶长之间的因果关系，也未确定其精确分子功能。需要包括基因编辑、转基因分析及细胞表型分析在内的进一步功能研究以阐明其生物学作用。总体而言，本研究鉴定到第4H染色体主效关联区域，并优先定位核心区间内的LOC123447426和LOC123450878以及作为较远候选的LOC123449930，供进一步研究大麦叶长变异的遗传与分子基础。
