《Toxics》：Arsenic Speciation–Thallium Synergy and AsB-Mediated Drivers of Arsenic Resistance Genes in a Large Reservoir
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砷（As）对饮用水安全构成风险，而砷抗性基因（AsRGs）调控砷的转化与归趋。尽管高砷压力下AsRGs的发生与富集已被充分研究，但其在低砷水生环境中的分布模式与驱动因素仍不清楚。本研究以丹江口水库这一低砷水源水为研究对象，采用季节性采样与宏基因组学方法对AsR
砷（As）对饮用水安全构成风险，而砷抗性基因（AsRGs）调控砷的转化与归趋。尽管高砷压力下AsRGs的发生与富集已被充分研究，但其在低砷水生环境中的分布模式与驱动因素仍不清楚。本研究以丹江口水库这一低砷水源水为研究对象，采用季节性采样与宏基因组学方法对AsRGs进行了调查。砷酸盐[As(V)]为主要无机形态，而亚砷酸盐[As(III)]表现出显著的季节性变化，春季和夏季较高。总AsRGs以arsC为主导，其次为arsB/ACR3，并呈现季节性变化。AsRGs与砷形态、环境因子及重金属相关，其中arsM及多种其他AsRGs与铊（Tl）、锑（Sb）和钼（Mo）强相关。冗余分析识别出As(V)、Mo、pH、溶解氧（DO）、二甲基砷酸（DMA）、铅（Pb）、镉（Cd）、Tl、钨（W）和铬（Cr）为核心变量，其中重金属的解释力最高。中介分析揭示砷甜菜碱（AsB）完全中介了锌（Zn）对arsB的效应。上述发现支持一个三重驱动框架——直接砷胁迫、重金属共选择与AsB介导的调控——阐明了低砷水体中AsRGs的增殖机制，并为水库风险管理提供支持。
研究背景方面，砷（As）作为一种在自然生态系统中广泛分布的类金属，因其高毒性和致癌性被列为优先污染物，全球约2亿人通过饮用水遭受砷暴露。大型水库作为关键饮用水源和重要生态缓冲体，其水质对区域公共健康具有深远影响。与河流水体不同，大型水库具有水力滞留时间长、季节性热分层显著以及沉积物–水界面相互作用强烈等固有特征，这些特征显著调控砷的迁移转化及微生物适应性响应。微生物在砷的生物地球化学循环中发挥核心作用，长期砷胁迫暴露驱动以ars系统为核心的微生物抗性机制的发生与富集，涵盖砷酸盐还原（arsC）、亚砷酸盐外排（arsB、ACR3）和砷甲基化（arsM）等功能基因。这些砷抗性基因（AsRGs）不仅使微生物适应高砷环境，还直接参与砷形态转化。尽管AsRGs已在土壤、海洋沉积物和地下水中得到广泛研究，但其在大型水库中的发生模式与驱动机制仍知之甚少。砷的毒性和环境归趋高度依赖于其化学形态，砷形态不仅反映环境条件变化，还可能作为选择压力影响AsRGs的表达，然而对低浓度水生环境中不同砷形态对AsRGs差异化驱动效应的系统认识仍然缺乏。砷甜菜碱（AsB）作为淡水系统中普遍存在的有机砷形态，长期被视为稳定的代谢终产物，其在微生物和海洋鱼类中作为有机渗透调节物质发挥作用，提示其在砷生物地球化学循环中的角色可能比传统认知更为复杂，但AsB在水库环境中的分布及其对AsRGs的调控效应尚未在野外研究中被探讨。此外，其他重金属也可能影响AsRGs的分布，不同抗性基因可共定位于质粒或基因组岛上，在环境选择压力下发生共选择和协同富集。铊（Tl）作为一种高毒性微量元素，常与砷在硫化物矿床中共存，并在采矿活动中同步释放进入水生环境，但现有研究主要集中于高浓度污染场景，对低浓度背景下铊与AsRGs之间协同关系的关注有限，其潜在机制仍不清楚。因此，有必要从重金属、砷形态与AsRGs耦合关系的角度系统研究AsRGs分布的多元驱动路径。基于此，研究人员选择丹江口水库作为研究区域，整合四季连续野外采样、砷形态检测、重金属定量和宏基因组测序，系统表征了水柱中AsRGs的分布模式，重点探究砷形态的直接驱动效应、铊的潜在协同效应以及AsB在重金属与AsRGs关系中的中介作用，以解析大型水库生态系统中AsRGs的多元驱动机制。
研究人员开展的研究及结论与意义方面，该研究通过对丹江口水库四个季节共56个采样点的表层水样进行采集，结合砷形态分析、重金属测定和宏基因组测序，系统揭示了低砷水库环境中AsRGs的分布特征及其多重驱动机制。研究得出以下主要结论：水库总砷浓度平均为2.75 μg/L，整体低于世界卫生组织（WHO）饮用水准则值10 μg/L，但春季入库河口S1点位出现31.56 μg/L的局部热点；As(V)为优势无机形态，占无机砷的75%以上，As(III)在春季和夏季比例显著升高；AsRGs以arsC为最优势亚型（平均占47.8%），其次为arsB/ACR3（29.4%），arsM占比最低（9.7%），且总丰度呈现显著季节性变化，秋季最高；Tl与arsM呈最强正相关（r = 0.740，p < 0.001），并与另外六种AsRGs显著相关，提示铊与砷的协同驱动效应；中介分析揭示AsB完全中介了Zn对arsB的效应（中介比例88.7%，p < 0.05）。该研究提出了直接砷形态胁迫、重金属共选择和AsB介导调控的三重驱动框架，阐明了低砷水体中AsRGs的增殖机制，揭示了AsB在淡水砷循环中此前未被认识的新生态角色，为水库水质管理和入库河口靶向监测提供了理论依据。
关键技术方法方面，研究人员在丹江口水库设置56个采样点进行四季采样（2025年春季10个、夏季16个、秋季15个、冬季15个），采集表层0.5 m水样；采用 inductively coupled plasma mass spectrometer（ICP-MS）测定16种重金属元素；采用 high-performance liquid chromatography coupled with ICP-MS（HPLC-ICP-MS）测定六种砷形态（As(III)、As(V)、MMA、DMA、AsC和AsB）；提取总DNA后经 Illumina NovaSeq 6000 平台进行宏基因组双端测序；利用 fastp、KneadData、MEGAHIT、Prodigal、MMseqs2 等工具进行序列质控、组装和开放阅读框预测，构建非冗余基因目录；通过 DIAMOND 比对 AsgeneDB 数据库注释砷代谢基因，利用 Kraken2/Bracken 进行物种分类注释及AsRG宿主鉴定；采用 Spearman 相关分析、冗余分析（RDA）和基于Bootstrap重采样的中介分析进行统计分析。
研究结果方面，第一，水环境特征与砷形态分布：水库物理化学参数呈现显著季节和空间变化，水温范围11.7–31.7 °C，溶解氧平均11.1 mg/L，pH值7.31–9.10，溶解氧和氧化还原电位（ORP）均冬季最高、夏季最低；大多数重金属浓度低于WHO准则值，仅春季S1点位砷超标，Mn浓度最高且空间异质性强烈，高值集中在西南入库河流区；总砷平均2.75 μg/L，As(V)为优势形态，As(III)检测频率23.2%且在入库河流区浓度升高，AsB检测频率达96.4%，MMA和DMA检测频率分别为50.0%和37.5%，AsC均低于检出限；As(III)占无机砷比例存在极显著季节差异（Kruskal–Wallis检验，p < 0.001），春季（47.6 ± 25.2%）和夏季（38.4 ± 24.4%）显著高于秋季（5.51 ± 7.14%）和冬季（5.66 ± 1.53%）。第二，AsRGs分布特征：共鉴定出12种砷代谢功能基因，核心AsRGs检测频率为100%，总丰度范围170.8–1168.2 TPM，均值721.2 ± 193.8 TPM；六种ars基因总丰度存在显著季节变化（χ2 = 10.97，p = 0.012），秋季（524.2 ± 73.7 TPM）显著高于夏季（403.2 ± 89.6 TPM）；Pseudomonadota为各季节绝对优势门；AsRG宿主分析显示Rubripirellula和Parvibaculum（携带arsC）、Acinetobacter（携带moeA）和Achromobacter（携带arsB）为主要宿主；基因组成以arsC为主导（39.6–55.3%），arsB/ACR3次之（22.5–36.2%），arsM占6.2–14.8%。第三，AsRGs与砷形态、环境因子及重金属的相关性：arsM与As(V)极显著正相关（r = 0.687，p < 0.001），arsA和ACR3也与As(V)显著正相关；pgpA与MMA和DMA极显著负相关；arsH和pgpA与AsB显著负相关；ACR与As(III)显著正相关但与As(V)负相关；DO与多种AsRGs显著正相关，ORP与pgpA、arsH、arsR和moeA显著正相关，水温与pgpA和arsH显著负相关；arsM与Tl呈所有基因–环境对中最强正相关（r = 0.740，p < 0.001），arsA、moeA、pgpA、ACR3和arsH也与Tl显著正相关；Sb与pgpA、arsH、moeA、arsA和arsR显著正相关；arsM与Co和Cu显著负相关，七种基因与Mo显著负相关。第四，冗余分析：前两轴解释39.9%的基因–环境变异，总解释变异71.6%（Monte Carlo检验，p < 0.01）；贡献最大的环境因子依次为As(V)（0.632）、Mo（0.617）、pH（0.590）、DO（0.586）、DMA（0.585）、Pb（0.584）、Cd（0.523）、Tl（0.507）、W（0.502）和Cr（0.483）；变异分解分析显示重金属净解释力最高（49.9%），砷形态次之（24.3%），物理化学参数最低（23.2%）。第五，中介分析：仅Zn → AsB → arsB路径达到统计显著，间接效应为?0.0056（p < 0.05），中介比例88.7%，为完全中介效应；Zn对AsB效应显著（a = ?0.469，p < 0.001），AsB对arsB效应显著（b = 0.012，p < 0.01），控制AsB后直接效应不显著（c' = ?0.001，p > 0.05）；另有三条路径呈边缘显著趋势（0.05 < p < 0.10）。
讨论部分总结方面，关于砷污染状况与形态分布特征，总砷均值低于WHO准则值但春季S1点位出现局部热点，提示局部砷输入值得进一步监测；As(V)为优势形态，与氧化性水体中砷的热力学稳定形态一致；春季低DO区域As(III)比例显著升高，与微生物介导的砷还原过程有关，较高春夏季As(III)比例可归因于入库河口较强的还原条件及高温（可达31.7 °C）驱动的微生物还原增强，宏基因组数据中砷酸盐还原功能基因的高丰度进一步支持了这一解释；Mn与总砷显著正相关但与As(III)和As(V)无显著相关，与Mn氧化物在氧化条件下吸附As(V)、还原条件下释放As(III)的机制一致；有机砷形态检测频率较低可能与arsM丰度较低（均值7.8 TPM）及甲基化过程受限有关。关于AsRGs分布特征，六种核心ars基因总丰度均值482.0 ± 131.5 TPM，秋季最高，可能与秋季NO3?-N峰值有关，营养驱动的微生物活性变化可能促进AsRGs的表达或水平转移；arsC为最优势亚型，arsH、arsR和pgpA与DO和ORP正相关但与水温和电导率负相关，表明微生物群落通过调整砷抗性策略适应季节性氧化还原波动；Pseudomonadota为各季节绝对优势门，Acinetobacter和Rubripirellula被鉴定为核心基因的主要宿主，提示微生物群落结构与AsRG潜力之间存在部分耦合；大量AsRG携带ORF被归类为"未分类细菌"，反映了当前数据库参考蛋白分类标签的缺乏。关于铊与砷的协同驱动机制，arsM与Tl极显著正相关且Tl与另外六种AsRGs显著相关，提示铊与砷之间可能存在协同驱动效应；Tl和As均为高毒性元素，微生物重金属抗性基因常簇集于质粒或基因组岛上并与转座子和整合子等移动遗传元件关联，水库中检测到高多样性的移动遗传元件，提示Tl抗性基因与砷抗性基因可能共定位于同一移动元件上发生协同共选择；Sb与五种AsRGs正相关，结合当地地质背景和上游采矿活动，提示锑为水库潜在污染物；arsM与Co和Cu负相关及七种基因与Mo负相关的机制有待进一步研究，一种可能解释是这些金属与砷竞争微生物摄取途径或高浓度Co和Cu对微生物产生普遍毒性从而间接抑制AsRGs表达；营养可用性方面，无机氮季节性波动且秋季NO3?-N较高，宏基因组功能分析揭示磷循环和硫循环基因的丰富存在，提示水库具有活跃的生物地球化学循环潜力。关于AsB的中介效应与研究局限，中介分析揭示Zn → AsB → arsB是唯一统计显著的中介路径（中介比例88.7%），而As(V)、As(III)、MMA和DMA均未识别出显著中介路径，进一步凸显AsB调控arsB表达的特异性；AsB传统上被视为无毒有机砷形态，其在淡水生态系统中的生态功能长期被忽视，本研究结果支持AsB可能作为信号分子或渗透调节物质参与调控arsB表达的假说，但分子机制需通过培养实验进一步验证。研究局限包括：未开展传统培养实验，未来需结合培养依赖的分离实验验证关键细菌类群的功能角色；未测定溶解态磷酸盐和硫酸盐的绝对浓度，仅从通路水平基因潜力推断其作用；单个点位缺乏空间重复限制了点位内水平的统计推断，尽管季节性采样提供了稳健的时间重复。
研究结论部分翻译：本研究提示低砷水库中的AsRGs在三种路径框架下运作：直接砷形态胁迫、重金属共选择和AsB介导的调控。总砷浓度保持较低水平（2.75 μg/L），但春季入库河口局部热点（S1，31.56 μg/L）值得关注。值得注意的是，Tl与砷表现出强协同效应（r = 0.740，p < 0.001），提示抗性基因的共选择。重要的是，宏基因组分析鉴定出Pseudomonadota为绝对优势门，Acinetobacter（Pseudomonadota）和Rubripirellula（Planctomycetota）等特定属被确认为核心AsRGs的关键宿主。此外，观察到活跃的营养循环潜力（如无机氮动态、磷和硫循环基因），这可能进一步影响微生物群落和AsRG分布。关键的是，中介分析揭示传统上被认为惰性代谢产物的砷甜菜碱（AsB）在Zn诱导的arsB调控中作为完全中介因子发挥作用（中介比例88.7%，p < 0.05），揭示了AsB在淡水砷循环中新的生态角色。上述发现为水库水质管理提供了理论依据，并凸显了对入库河口进行靶向监测的必要性。
