一种灵敏可靠的UPLC-MS/MS方法用于同时定量测定39种大麻素及其代谢物

《Toxics》：Method Development for a Sensitive and Reliable Quantification of 39 Total Cannabinoids and Their Metabolites by UPLC-MS/MS

　　

全球药用和娱乐用大麻使用量的增长提高了对^Δ9-四氢大麻酚（THC）、大麻二酚（CBD）及相关化合物的关注度。本研究开发了一种快速超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，并在标准溶液中评估了该方法对39种大麻素及大麻素代谢物的同时测定能力。研究人员对色谱和质谱条件进行了优化，并参照ANSI/ASB Standard 036的相关要素评估了校准性能、偏差、精密度、残留效应、检测能力和色谱选择性。在39种目标分析物中，38种分析物的校准决定系数（R²）≥ 0.990；7-OH-CBD的R²为0.975，因其偏差和精密度仍可接受而保留为暂定性表征分析物，尽管其校准性能和定量限（LOQ，0.500 ng/mL）劣于其他分析物。大多数关键异构体对实现了基线分离，而^Δ9-THCV/^Δ8-THCV仅部分分离（Rs = 1.12）。本研究结果在标准溶液中建立了宽泛面板方法开发的基础。在将该方法定量应用于生物、法医、废水或环境样品之前，必须评估基质效应、提取回收率、稳定性、稀释完整性和内标校正。

研究背景：全球大麻使用人数持续增长，截至2023年约2.44亿人使用大麻，占全球人口约4.6%。截至2024年，加拿大多国已修订立法允许非医疗用途大麻使用，大麻产业和商业大麻衍生产品大幅增长。美国37个州和4个领地允许医疗大麻使用，18个州和哥伦比亚特区允许娱乐用大麻。大麻素及其转化产物越来越多地在生物废物流中检出，通过尿液和粪便排泄进入废水系统并最终进入地表水。大麻素代谢物如11-OH-^Δ9-THC和11-COOH-^Δ9-THC在毒理学和暴露研究中常被检测。然而，目前大多数已发表方法仅针对少数大麻素或少数代谢物，导致对生物、法医和环境样品中大麻来源化合物的表征不完整。同时测定大量大麻素仍面临挑战，因为许多化合物具有相似化学结构、产生密切相关的质谱碎片，且浓度范围宽。大麻素代谢物，特别是羟基化、羧基化和葡萄糖醛酸化衍生物，理化性质多样，使色谱分离和定量分析复杂化。随着大麻产品持续多样化和新大麻素类似物出现，亟需快速、灵敏且经过验证的分析方法，能够以高选择性和可靠性同时定量更广泛的大麻素和代谢物。本研究旨在将分析面板扩展至39种大麻素和代谢物，包括主要植物大麻素、酸性前体、羟基化代谢物、羧基化代谢物和葡萄糖醛酸结合物，使用UPLC-MS/MS方法在标准溶液中开发，以ANSI/ASB Standard 036相关条款为验证框架。研究目标为：（i）将分析覆盖范围扩展至39种大麻素和代谢物；（ii）在标准溶液中表征校准、偏差、精密度、残留效应、灵敏度和色谱选择性；（iii）为后续基质特异性验证奠定基础。

关键技术方法：研究人员采用Waters Acquity Premier UPLC系统与Waters Xevo TQ Absolute串联质谱仪联用，在Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 × 50 mm，1.7 μm）上以30 °C进行分离，自动进样器温度10 °C，流速0.50 mL/min，总运行时间16 min。流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液，进样体积5 μL。质谱检测采用ZSpray电喷雾电离（ESI）源，正负离子模式均进行评估，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压10 V，脱溶剂温度450 °C。碰撞能量以5 eV递增从10至35 eV系统评估。每个分析物选择最丰富且可重现的产物离子用于多反应监测（MRM）分析。方法验证参照ANSI/ASB Standard 036进行，评估选择性、校准模型性能、偏差、精密度、残留效应和检测能力。校准曲线范围0.05–100 ng/mL，采用1/x²加权线性回归。偏差和精密度使用低（0.25 ng/mL）、中（2.5 ng/mL）、高（25 ng/mL）三个浓度水平的QC样品，五次运行、三次重复测定。

研究结果：

3.1 UPLC-MS/MS最佳条件：优化的UPLC-MS/MS方法成功实现了39种大麻素和大麻素代谢物的分离和检测。所有化合物在12 min内实现色谱分离，包括多种结构相似和异构大麻素。7-COOH-CBD、7-OH-CBD和6′,7′-diOH-CBC保留时间最短，分别为1.47、1.57和1.58 min；^Δ8-THCA-A、CBCA和CBLA保留最强，分别为9.75、10.69和11.01 min。正离子电喷雾电离（ESI+）对所有目标分析物产生最高信号响应，因此被选用于定量分析。多种异构大麻素产生相同前体离子和相似产物离子谱，导致相同MRM跃迁和碰撞能量设置，因此色谱保留时间和基线分离对于这些化合物的可靠鉴定和定量至关重要。优化色谱分辨率和选择性MRM检测的组合实现了全部39种大麻素和代谢物的准确区分和定量。38种分析物校准性能可接受（R² ≥ 0.990），7-OH-CBD未达到该校准标准（R² = 0.975），因此报告为暂定性表征而非完全验证。大多数异构体对实现基线分离，^Δ9-THCV/^Δ8-THCV对仅部分分离（Rs = 1.12）。

3.2 校准曲线和统计学结果：最高校准标准后分析的空白样品中未观察到超过各自LOD的分析物残留效应。在0.05–100 ng/mL校准范围内进行五次分析运行，采用1/x²加权线性回归。38种分析物满足R² ≥ 0.990和反算偏差在±20%以内的预设标准。大多数分析物的LOQ为0.050 ng/mL，^Δ8-THCV、CBCVA、11-OH-CBN、11-OH-^Δ9-THC、8β-OH-^Δ9-THC、11-COOH-^Δ9-THCV、CBE和7-OH-CBD除外。LOD值范围从^Δ9-THC的0.001 ng/mL到8β-OH-^Δ9-THC的0.179 ng/mL。7-OH-CBD虽满足QC偏差和精密度研究接受限，但其R²为0.975未达到校准标准，LOQ为0.500 ng/mL高于其他分析物，因其分析相关性保留在面板中但视为暂定性表征。39种分析物的偏差范围为?8.77%至15.21%，批内精密度范围为1.09%至17.21% CV，批间精密度范围为1.49%至11.95% CV。大多数分析物在三个QC水平上偏差在±5%以内、精密度低于10% CV。部分羟基化代谢物包括7-OH-CBD在低QC浓度显示较大变异性，但仍在预设偏差和精密度限内。对于未来涉及复杂基质的应用，分析物鉴定应基于保留时间与认证参考标准的一致性以及定性/定量离子比的一致性。

3.3 色谱分离：

3.3.1 总体分析：39种目标大麻素和代谢物的总离子色谱图显示所有分析物在12 min分析运行内检测和分离。0至4 min之间观察到较高峰密度， due to多种极性代谢物具有相似保留特性洗脱。尽管多个分析物在该时间窗口内洗脱，色谱分辨率足以通过保留时间和优化MRM跃迁的组合实现可靠鉴定和定量。色谱图显示最小背景干扰和良好信噪比，表明方法具有良好的灵敏度和选择性。

3.3.2 正/负离子化模式：在方法开发过程中评估了正负电喷雾电离模式以确定最佳离子化条件。正离子ESI对所有分析物一致产生显著更高的信号强度，因此被选用于最终分析方法。两种离子化模式下观察到相同的色谱保留时间，但正离子模式下信号响应显著更高。例如，大麻艾尔松（CBE）在两种模式下保留时间均为2.91 min，但正离子模式峰强度（2.61 × 10⁸ AU）比负离子模式（1.69 × 10⁶ AU）高约两个数量级。

3.3.3 异构体化合物的色谱分离：通过检查单个大麻素和代谢物的提取离子色谱图进一步评估色谱性能。将39种分析物按母体大麻素类别、结构相似性或分子量组织为六组。代表性色谱图显示良好峰形、最小基线干扰和一致保留行为。对于共享MRM跃迁的异构体，色谱保留时间是主要区分因素，辅以定性/定量离子比。提取离子色谱图确认^Δ9/^Δ8-THCA-A（Rs = 3.15）、^Δ9/^Δ8-THCVA（Rs = 2.23）和^Δ9/^Δ8-THC（Rs = 1.67）的基线分离，而^Δ9/^Δ8-THCV部分分离（Rs = 1.12）。

3.3.4 母体大麻素及其代谢物的分离：优化的色谱条件为母体大麻素及其生物转化产物提供了不同保留时间，包括羟基化、羧基化和葡萄糖醛酸化代谢物。^Δ9-THC与其主要代谢物11-OH-^Δ9-THC和11-COOH-^Δ9-THC的分离以及CBD相关化合物CBD、7-OH-CBD和7-COOH-CBD的区分。含羟基、羧基或葡萄糖醛酸官能团的代谢物在不同于相应母体大麻素的保留时间洗脱。羟基化和羧基化代谢物极性增加导致在反相色谱条件下比相应母体大麻素更早洗脱。色谱保留时间和化合物特异性MRM跃迁的组合提供了额外水平的选择性。

3.3.5 额外^Δ8-和^Δ9-THC代谢物的分离：在方法开发过程中评估了额外^Δ8-和^Δ9-THC代谢物异构体。较浅梯度（60–24% A）增加了分析物保留并略微改善了若干异构体代谢物对的分离，但导致较低信号强度和较长分析时间。较陡梯度（80–24% A）产生较高分析物响应和改善的分析效率，同时保持可比色谱选择性。尽管优化了梯度条件，两种洗脱程序之间仅观察到微小分辨率差异。若干代谢物对包括11-OH-^Δ8/^Δ9-THC、11-COOH-^Δ8/^Δ9-THC、11-COOH-^Δ8/^Δ9-THCV和^Δ8/^Δ9-THC-葡萄糖醛酸苷在两种梯度条件下均仅部分分离。这些代谢物未纳入最终验证方法，需要进一步研究。

讨论部分总结：本研究在标准溶液中建立了39种分析物的方法开发平台而非复杂基质的完全验证程序。与近期靶向16种大麻素的方法、血液和尿液中THC异构体及相关分析物方法、大麻花中18种大麻素方法或大麻油中更大天然/合成面板相比，主要贡献是在12 min分析窗口内联合包含植物大麻素、酸性前体、I相代谢物和一种葡萄糖醛酸苷。结构相似的大麻素异构体仍是核心分析挑战，因为相同分子量和重叠MS/MS跃迁可使质谱区分不足。本方法实现了^Δ9/^Δ8-THC、^Δ9/^Δ8-THCA-A和^Δ9/^Δ8-THCVA的基线分离。面板包括母体大麻素和选定代谢物。7-OH-CBD虽校准弱于其他分析物但仍具生物学相关性。葡萄糖醛酸苷在源内可能碎裂为苷元离子，因此色谱分离和跃迁/离子比行为验证对于防止假阳性或高估至关重要。大麻素酸包括THCA、CBDA、CBCA、CBGA及相关异戊酸类易受时间、温度和条件依赖性脱羧转化为相应中性大麻素。低溶剂基LOD展示仪器响应但不应直接等同于特定应用的适用性。基质相关离子抑制或增强、不完全提取、分析物损失、内源性干扰、吸附和不稳定性均可使灵敏度相对于纯标准溶液恶化。因此，应用特异性LOQ必须在每种基质中独立建立。

结论翻译：本研究建立了一种12 min UPLC-MS/MS分析方法，用于在纯溶剂标准中同时筛查和定量39种大麻素和代谢物。该方法展示了广泛的分析物覆盖、可接受的溶剂相准确度和精密度、可忽略的残留效应以及绝大多数关键同分异构体和结构异构体对的基线色谱分离。显著的分析注意事项包括^Δ9-THCV和^Δ8-THCV的部分分离以及7-OH-CBD的暂定性校准线性，两者均突显了进一步色谱和采集调谐的目标。未使用内标（IS）校正开发该初始工作流程的决定反映了研究的主要目标：在广泛化学面板中基准评估保留能力、色谱选择性和质谱响应因子。尽管常规稳定同位素标记标准品可商业获得，但覆盖全部39种目标分析物的真实同位素异构体并非常规可用。仅使用有限数量替代标准品归一化数据可能引入差异偏差，因为少数通用替代品无法充分反映中性、酸性和羟基化大麻素亚类之间不同的保留特征、提取效率和电喷雾电离行为。此外，面板范围受商业可获得的认证参考物质限制；新兴新型精神活性大麻素以及额外未解析代谢物异构体超出本预定义范围。由于评估仅限于溶剂溶液，若干关键生物分析和环境验证参数，特别是基质效应（离子抑制/增强）、提取回收率、自动进样器和台面稳定性、稀释完整性和内源性基质干扰，仍未评估。因此，虽然该12 min工作流程为宽泛面板分析提供了高效平台，但转化为复杂法医、临床、废水或环境基质将需要全面的单实验室验证。这必须纳入基质特异性样品制备、针对共提取基质组分的严格选择性测试以及类别匹配的稳定同位素稀释以确保稳健的定量可靠性。