《Journal of Fungi》：The First Complete Mitochondrial Genome of Sarcomyxa edulis (Agaricales): Genomic Characterization and Comparative Analysis with 23 Additional Agaricales Species
编辑推荐：
杨树桑黄（*Sarcomyxa edulis*，桑黄科Sarcomyxaceae，伞菌目Agaricales）是原产于东北亚的具有重要经济价值的食药用菌。尽管其核基因组和转录组图谱已被表征，但其线粒体基因组仍未被探索，这阻碍了对其进化动态及在伞菌目中系统发育地
杨树桑黄（*Sarcomyxa edulis*，桑黄科Sarcomyxaceae，伞菌目Agaricales）是原产于东北亚的具有重要经济价值的食药用菌。尽管其核基因组和转录组图谱已被表征，但其线粒体基因组仍未被探索，这阻碍了对其进化动态及在伞菌目中系统发育地位的全面理解。本研究采用PacBio HiFi长读长测序技术组装了杨树桑黄的完整线粒体基因组。该线粒体基因组由一条248,416 bp的环状分子组成，GC含量为28.02%，超出大多数伞菌目线粒体基因组的典型大小范围。共鉴定出51个基因，包括15个蛋白编码基因（PCGs；14个保守核心PCGs加rps3）、34个tRNA基因和2个rRNA基因；此外还预测了153个开放阅读框（ORFs）。基因组扩张主要归因于基因间区（61.15%）和内含子序列（30.14%）的增殖。密码子使用分析揭示出对AT富密码子的显著偏好，与整体核苷酸组成偏好一致。共鉴定出976个重复元件，包括465个简单序列重复（SSRs）、216个串联重复和295个散在重复。与23个其他伞菌目物种的比较分析表明，杨树桑黄拥有伞菌目中最大的线粒体基因组之一，具有广泛的内含子含量（40个内含子；cox1中12个，cob中8个，cox2中7个）、丰富的重复元件（976个；465个SSRs、216个串联重复和295个散在重复）、超过91%的非编码比例（基因间区61.15%和内含子区30.14%）以及独特的基因排序（rrn23-cox3-atp8-nad2-nad3-atp9-rrn16-cox1-cox2-nad6-nad4L-nad5-nad4-rps3-cob-nad1-atp6），使其区别于其他伞菌目线粒体基因组。Ka/Ks分析表明所有核心PCGs主要受纯化选择作用，其中atp6、cox3和nad5表现出最高的核苷酸分歧。基于串联线粒体PCGs的系统发育重建将杨树桑黄恢复为小菇属（Mycena）分支的姐妹谱系，但支持度较弱（BS = 49%）。因此该位置应被视为暂定的，且此处分析的单一桑黄科代表限制了伞菌目内科级关系的分辨率。本研究提供了杨树桑黄线粒体基因组的首个全面表征，为阐明这一具有商业重要性真菌及未被充分探索的桑黄科的进化和系统发育提供了宝贵的基因组资源。其独特的基因组特征，包括广泛的内含子含量、非典型基因排序和丰富的重复元件，凸显了伞菌目线粒体基因组进化的动态特性。
杨树桑黄（*Sarcomyxa edulis*）是原产于东北亚的具有重要商业价值的食药用菌，在中国俗称"元蘑"或"冻蘑"。该耐冷物种分布于中国东北、韩国、日本和俄罗斯远东地区的寒冷区域，生长于榆树、椴树和桦树等阔叶树的腐木上。杨树桑黄以其柔嫩质地、可口风味和优异营养特性而闻名，粗蛋白含量为19.23%至23.79%，总糖含量超过61%。除食用意义外，该菌还表现出显著的药用特性，包括抗氧化、抗炎和保肝活性，使其成为食品和制药应用的宝贵资源。桑黄属（*Sarcomyxa* P. Karst.）是伞菌目中的一个小类群。近期的分类学研究基于形态特征及ITS、nrLSU、RPB2和TEF1-α的多位点系统发育分析，描述了中国两个新种——*S. baishanzuensis*和*S. ochracea*。加上这些新增分类单元，该属目前在全球包含四个公认分类单元——*S. baishanzuensis*、*S. edulis*、*S. ochracea*和*S. serotina*，其中三个（*S. baishanzuensis*、*S. edulis*和*S. ochracea*）已在中国确认。在这四个物种中，杨树桑黄是目前唯一已成功人工栽培并被认为可食用的物种，使其成为重要的食用菌。杨树桑黄的完整基因组序列此前已有报道，揭示其约35.65 Mb，注释有9364个蛋白编码基因，包括411个参与木质纤维素降解的碳水化合物活性酶。在研究人员此前的研究中，系统分析了杨树桑黄六个发育阶段的转录变化，利用比较转录组和WGCNA鉴定了参与木质纤维素降解的关键基因，并成功建立了该物种的人工栽培体系。尽管取得了这些进展，杨树桑黄的线粒体基因组——其遗传架构的关键组成部分——尚未被表征。线粒体基因组因其紧凑的大小、高拷贝数、快速进化速率和单亲遗传而成为进化和系统发育研究的宝贵工具。真菌线粒体基因组通常包含14个参与氧化磷酸化的核心PCGs，以及rRNA和tRNA基因。然而，在大小、基因排序和内含子含量方面存在显著变异，主要由内含子、基因间区和重复序列的增殖驱动。伞菌目内的比较线粒体基因组研究已揭示广泛的基因重排和动态的内含子获得/丢失事件。cox1基因代表真菌线粒体基因组中最大的内含子储库。例如，对双孢蘑菇（*Agaricus bisporus*）的全球线粒体基因组分析在361个菌株中鉴定了30种内含子分布模式，栽培品种表现出归因于驯化的内含子丢失。杨树桑黄所属的桑黄科尚未有线粒体基因组报道，这在该科的线粒体基因组覆盖方面留下了明显空白。相比之下，近缘的小菇科（Mycenaceae）已有*Mycena pura*的记录完善的线粒体基因组（107,684 bp；14个核心PCGs、25个tRNAs、2个rRNAs、11个非保守ORFs、7个基因中鉴定出18个内含子）。然而，小菇科包含9个属约1500个物种，仅有一个线粒体基因组的可用性使该科严重取样不足，极大地阻碍了对这一生态重要谱系内进化动态和系统发育关系的理解。因此，存在两个不同的知识空白：（i）桑黄科线粒体基因组数据的完全缺失；（ii）小菇科内线粒体基因组取样的稀疏。杨树桑黄作为桑黄科第一个具有完整线粒体基因组的代表，直接填补了第一个空白，并为该科提供了关键的基因组资源。尽管它无法填补小菇科的取样空白，但可作为未来小菇科研究及解析桑黄科与小菇科之间关系的有价值比较参考；尽管如此，仍需更多小菇科线粒体基因组来解决第二个空白。本研究呈现了使用PacBio HiFi长读长测序组装的杨树桑黄首个完整线粒体基因组。全面表征了其基因组架构，通过与其它伞菌目的比较分析研究了驱动基因组大小变异和内含子动态的进化力量，并重建了其系统发育位置。这些发现填补了桑黄科线粒体基因组学的关键空白，并为伞菌目线粒体基因组进化提供了见解。研究人员从中国吉林省白山市靖宇县一位种植者处获得纯菌丝体分离的杨树桑黄菌株（编号ym20250708），该菌株是东北地区最广泛栽培的品种，保存于山西农业大学棉花研究所。菌丝体在25 °C黑暗条件下于商品化马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板（90 mm）上培养20天。采用CTAB法提取总基因组DNA。高质量基因组DNA送至南京集思慧远生物科技有限公司进行PacBio Sequel II（Pacific Biosciences）HiFi长读长模式测序。线粒体基因组组装采用参考引导结合从头组装策略。首先使用Minimap2 v2.1将原始HiFi reads比对到近缘物种的参考线粒体基因组序列（*Mycena pura* PV935538.1、*Lyophyllum decastes* MH447974、*Armillaria borealis* MH407470和*Moniliophthora roreri* HQ259115），随后使用Canu v2.0以默认参数组装比对上的reads。通过将三代测序reads映射到组装contig并用MUMmer4可视化验证环状性，覆盖图显示reads跨越推定连接处，支持线粒体基因组的环状构象。鉴于线粒体基因组从总基因组DNA组装，评估了核线粒体插入（NUMT）污染风险。多条证据表明最终组装无NUMT污染：首先，平均HiFi读长（20,151 bp）超过大多数NUMT的长度，且跨越多个基因边界的reads被一致回收；其次，read映射显示整个环状分子覆盖均匀（平均15,448×），无NUMT来源区域特征的局部覆盖峰值或不连续；第三，所有15个PCGs经证实具有完整开放阅读框，无内部终止密码子或移码；第四，与已发表的杨树桑黄核基因组进行BLASTN比较未检索到显著匹配。基因注释采用整合同源性搜索和从头预测的多步骤策略。PCGs和rRNA基因最初通过BLAST搜索近缘真菌参考线粒体基因组鉴定，随后基于与系统发育近缘分类单元直系同源基因的比对进行人工修正。使用真菌线粒体遗传密码（遗传密码4）鉴定14个保守核心线粒体PCGs（atp6、atp8、atp9、cob、cox1、cox2、cox3、nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L、nad5、nad6）。使用tRNAscan-SE v2.0以真菌线粒体基因组默认参数预测tRNA基因，使用ViennaRNA软件可视化tRNA二级结构并人工检查确认经典三叶草构型。使用NCBI Open Reading Frame Finder以最小长度阈值102 bp鉴定ORFs。杨树桑黄线粒体基因组包含15个蛋白编码基因（PCGs），包括14个参与氧化磷酸化的保守核心PCGs加一个额外的核糖体蛋白基因rps3。在本研究中，14个核心PCGs用于系统发育和比较线粒体基因组分析，而所有15个PCGs纳入密码子使用和选择压力分析。对于比较分析，纳入四个与杨树桑黄近缘的物种：*Mycena galericulata*（OZ252609）、*M. inclinata*（BK073587）、*M. arcangeliana*（BK073585）和*M. pura*（PV935538）。由于*M. galericulata*、*M. inclinata*和*M. arcangeliana*的GenBank记录缺乏注释，本研究对其线粒体基因组进行了结构注释。从组装序列计算基因组大小、GC含量和核苷酸组成，使用公式AT-skew = (A ? T)/(A + T)和GC-skew = (G ? C)/(G + C)评估链不对称性。使用OGDRAW v1.3.1生成线粒体基因组环状图。进行基因含量比例分析以量化编码区、RNA基因、基因间区和内含子序列对总基因组大小的相对贡献。使用相对同义密码子使用（RSCU）指标评估同义密码子使用偏好。使用MISA v1.0检测简单序列重复（SSRs），使用TRF v4.09鉴定串联重复，使用BLASTN v2.10.1鉴定散在重复，使用Circos v0.69-5可视化所有三类重复的基因组分布。使用KaKs_Calculator v2.0以MLWL方法计算直系同源基因对的同义（Ks）和非同义（Ka）替换率，Ka/Ks > 1表示正选择，= 1表示中性进化，< 1表示纯化选择。使用MAFFT v7.505比对直系同源基因序列，使用DnaSP v5计算每个基因的核苷酸分歧（Pi）。使用14个核心PCGs的串联线粒体PCG序列进行系统发育重建。使用MAFFT v7.505比对个体基因序列并按atp6-atp8-atp9-cob-cox1-cox2-cox3-nad1-nad2-nad3-nad4-nad4L-nad5-nad6顺序串联，使用trimAl v1.4.rev15以-gt 0.7参数修剪。使用jModelTest v2.1.10基于Akaike信息准则确定最佳拟合核苷酸替换模型为GTR+G+I。使用RAxML v8.2.10以GTRGAMMAI模型和1000次bootstrap重复进行最大似然（ML）系统发育分析。使用BLASTN进行线粒体共线性分析，仅保留长于300 bp的比对。通过提取每个物种核心PCGs和rRNA基因的排列进行基因排序比较，并与系统发育树一起可视化。系统分析线粒体基因内含子的分布和位置，计算cox1基因内含子位置基于前述外显子累积长度并按位置类别命名系统分类。检验多个真菌物种中内含子数与线粒体基因组大小的关系。
3.1 杨树桑黄线粒体基因组的一般特征
经过文库构建和PacBio Sequel II HiFi测序，共获得杨树桑黄190,425条reads，包含3,837,373,196个碱基，平均读长20,151 bp，N50读长20,070 bp。原始PacBio HiFi测序数据已存入NCBI Sequence Read Archive（SRA），BioProject编号PRJNA1480987。构建了环状基因组图和基因含量比例图以表征杨树桑黄线粒体基因组的基因组架构。环状基因组图描绘了所有注释基因在正反链上的分布和转录方向及GC含量谱，基因分布相对均匀，未形成明显的功能簇，而几个基因间区表现出显著扩张。内部GC含量轨迹显示整个基因组GC水平持续偏低，区域波动极小，与真菌线粒体基因组的AT富集特性一致。基因含量比例图总结了不同基因组组分的绝对长度和比例组成：基因间区构成最大部分，为151,900 bp（61.15%），其次是内含子区74,863 bp（30.14%），蛋白编码区13,762 bp（5.54%），RNA序列（包括tRNA和rRNA基因）7,891 bp（3.18%）。总体而言，非编码区（基因间区和内含子区）超过总基因组的91%，表明杨树桑黄线粒体基因组扩张主要由基因间序列和内含子的积累驱动。这些结果表明相对宽松的线粒体基因组架构，基因组大小膨胀主要归因于非编码元件的增殖。杨树桑黄线粒体基因组包含34个tRNA基因，共同编码所有20种标准氨基酸。某些氨基酸由多个tRNA基因代表，包括四个共享相同反密码子的tRNA-Met拷贝，以及两个tRNA-Arg、tRNA-Leu和tRNA-Ser拷贝各具有不同反密码子。所有tRNA基因均预测折叠为经典三叶草二级结构，个体长度范围为71至87 bp。tRNA基因间的长度变异主要反映额外臂的扩张或收缩，较大的tRNA基因（如trnS、trnL和trnY）通常具有较长的额外臂。非Watson-Crick碱基配对，主要为G-U错配，在茎内常见——这是真菌线粒体tRNA的特征。tRNA基因分散于整个线粒体基因组，在某些基因间区有显著聚集；34个tRNA基因中，21个位于正链，13个位于反链。杨树桑黄线粒体基因组共预测153个ORFs，分布在整个环状分子上，长度范围为102 bp至2388 bp，位于正反链上。根据相对于外显子-内含子边界的坐标，153个预测ORFs中41个位于注释内含子内，112个位于基因间区。针对NCBI非冗余蛋白数据库的BLASTP搜索对31个ORFs返回显著命中（E < 1 × 10??），分为四类：归巢内切酶/成熟酶相关蛋白（2个ORFs：ORF83和ORF80）、呼吸链亚基（6个ORFs：cob、cox1、nad2、nad3和nad4）、其他已知蛋白（1个ORF：部分DNA聚合酶）和未表征/假设蛋白（22个ORFs）。其余122个ORFs，包括大多数112个基因间区ORFs，缺乏显著BLASTP命中，保留为假设ORFs。大多数BLASTP命中为植物线粒体或核编码蛋白，反映线粒体结构域的远缘保守性而非近缘真菌直系同源物。41个内含子ORFs富集于cox1、cob和cox2，与该线粒体基因组中的内含子分布一致。
3.2 密码子使用和重复序列分析
为阐明杨树桑黄线粒体基因组内的同义密码子使用模式，计算了所有PCGs的RSCU值。排除终止密码子后，共分析15个PCGs的4614个密码子。RSCU环形图揭示具有升高RSCU值的密码子（如AGA、UUA、GCU、CCU、GGU）主要位于图的上部，均在第三密码子位置富集A或U。相反，RSCU值接近零的密码子（如CGC、CUC、CGG、GGC）集中在下部，与其在线粒体基因组中的低 representation 一致。RSCU条形图总结每个氨基酸的累积密码子使用偏好，亮氨酸显示最高的累积RSCU总和，主要归因于对UUA的极端偏好（RSCU = 4.01），而CUC极少使用（RSCU = 0.04）。类似地，精氨酸显示出对AGA的显著偏好（RSCU = 4.44），而CGC完全缺失（RSCU = 0）。丙氨酸和甘氨酸也表现出显著偏好，GCU和GGU为压倒性偏好的密码子（RSCU分别为2.24和2.05）。总体而言，这些发现表明杨树桑黄线粒体基因组具有显著的密码子使用偏好，特征为对AT富密码子的显著偏好和对GC富同义替代的明显回避，与线粒体基因组的整体AT富集组成（GC含量 = 28.02%）一致，暗示突变压力与自然选择共同在塑造该生物密码子使用中发挥了关键作用。为表征杨树桑黄线粒体基因组内的重复元件，鉴定并注释了三类重复：SSRs、串联重复和散在重复。共检测到976个重复序列，包括465个SSRs（47.6%）、216个串联重复（22.1%）和295个散在重复（30.2%）。SSRs构成最丰富的重复类别，以单核苷酸和二核苷酸基序为主——这与线粒体基因组的AT富集特性一致。串联重复在拷贝数和基序长度方面表现出相当大的变异，相当比例定位于基因间区。通过BLASTN分析鉴定的散在重复分布在全基因组，比对长度跨越35–363 bp，序列相似性范围为70.64%至100%。值得注意的是，多个散在重复显示出高度序列保守性，某些元件相似性超过90%（如195 bp，98.974%；119 bp，96.639%），表明特定重复元件在线粒体基因组内进化保守。如Circos图所示，重复在基因组中非均匀分布，在几个基因间区和靠近含内含子基因处观察到显著聚集，表明这些位点可能作为基因组重排和重组的热点。重复的丰度和非随机分布，特别是在非编码区内，进一步证实了重复元件对杨树桑黄线粒体基因组扩张和结构可塑性有重大贡献的假设。
3.3 线粒体PCGs的进化约束和核苷酸分歧
为评估作用于线粒体PCGs的选择压力，计算了杨树桑黄与11个代表性伞菌目物种之间直系同源基因对的Ka/Ks比值（非同义与同义替换率之比，p值 ≤ 0.05）。在所有成对比较中，15个PCGs的绝大多数表现出显著低于1的Ka/Ks值，表明这些基因主要受纯化选择作用。其中，cox1、cox2、cob、nad4、nad5和nad4L显示出最低的Ka/Ks值（大多< 0.2），反映对这些呼吸链组分的严格功能约束。相比之下，rps3（核糖体蛋白S3）表现出最高的Ka/Ks值，某些成对比较超过1.0（如杨树桑黄 vs. MH823225：Ka/Ks = 1.01176；vs. HQ259115：Ka/Ks = 1.07907），但均未达到统计学显著性（p > 0.05）。nad6基因在几个比较中也表现出升高的Ka/Ks比值（范围0.196至0.753），表明相对于其他核心基因选择约束较为宽松。箱线图分析进一步描绘了各基因Ka/Ks值的分布，大多数基因表现出窄的四分位距和有限的异常值，与总体进化保守性一致。然而，rps3和nad6呈现更宽的分布和更大的种间变异性，暗示谱系特异性进化动态。值得注意的是，大多数基因（14–15个中的15个）在所有成对比较中维持Ka/Ks值低于1，确认纯化选择构成支配杨树桑黄线粒体基因库的主要进化力量。这些发现表明参与氧化磷酸化的线粒体基因在氨基酸水平高度保守，而rps3可能经历宽松的选择约束或初期正选择。呼吸链基因上显著的纯化选择凸显了它们在维持伞菌目线粒体功能中不可或缺的作用。通过杨树桑黄与其他伞菌目物种的比较分析，估算了13个PCGs（atp6、atp8、atp9、cob、cox1、cox2、cox3、nad1、nad3、nad4、nad4L、nad5和nad6）的Pi。nad2和rps3被排除在此分析之外，因为它们表现出较差的核苷酸水平同源性，只能部分比对，且直系同源序列不足或比对模糊，可能引入过度分歧。Pi值范围为0.19253（atp8）至0.28722（atp6），所有检查基因的全基因组平均值为0.23284。在分析的基因中，atp6表现出最高的核苷酸分歧（Pi = 0.28722），其次是cox3（0.27998）、nad5（0.24722）和nad1（0.24301）。这些基因也具有高数量的可变位点（分别为483、501、1099和536），将其鉴定为线粒体基因组内最具多态性的区域之一。相比之下，atp8显示最低的Pi值（0.19253），其次是nad4L（0.19592）。其他基因如cox1（Pi = 0.20111）也表现出相对低的核苷酸分歧。基因间核苷酸分歧的异质分布表明某些线粒体位点——特别是atp6、cox3和nad5——可能因其升高的多态性水平而作为群体遗传学研究的 promising 分子标记。相反，高度保守的基因如nad4L可能更适合于更深分类阶元的系统发育推断。
3.4 伞菌目物种的比较线粒体基因组分析
线粒体共线性分析显示，在四个小菇属物种之间的比较中，同源序列占参考基因组的12.49–22.62%和查询基因组的17.60–30.98%。具体而言，*M. galericulata*–*M. inclinata*比较显示参考和查询基因组同源性分别为22.62%和25.01%；*M. inclinata*–*M. arcangeliana*显示20.18%和17.60%；*M. arcangeliana*–*M. pura*显示12.49%和30.98%。相比之下，当杨树桑黄与*M. pura*比较时，仅杨树桑黄线粒体基因组的6.58%和*M. pura*基因组的13.99%为同源。值得注意的是，杨树桑黄在所有比较中表现出最低的查询基因组覆盖度（6.58%），表明杨树桑黄与*M. pura*之间的线粒体共线性相对有限。在系统发育树背景下跨物种线粒体基因排序比较分析显示，基因排列在近缘物种间相对保守，但在远缘谱系间高度变异。在小菇属内，四个物种（*M. galericulata*、*M. inclinata*、*M. arcangeliana*和*M. pura*）已显示出基因排序的显著差异，而杨树桑黄表现出与所有小菇属物种明显不同的排列，支持其在系统发育树中置于小菇属分支之外的位置。相比之下，*Lyophyllum decastes*和*L. shimeji*、*Laccaria amethystina*和*L. bicolor*以及三个灵芝属物种显示出高度相似或几乎相同的基因排序。在本比较中，基因排序在近缘物种间相对保守，但杨树桑黄与四个小菇属物种之间差异显著。科级更广泛的结论将需要来自桑黄科和小菇科的额外完整线粒体基因组。为阐明内含子对线粒体基因组大小变异的贡献，分析了包括杨树桑黄在内的24个伞菌目物种中内含子数与基因组大小的关系。基因组大小从49,704 bp（*Schizophyllum commune*）到273,121 bp（*Mycena arcangeliana*），代表超过五倍的变异，而内含子数范围为0至64。观察到内含子数与基因组大小之间明显的正相关。具有较大基因组的物种始终包含更多内含子，而具有较小基因组的物种拥有较少或无内含子。杨树桑黄基因组为248,416 bp，含40个内含子，超出大多数伞菌目线粒体基因组的典型大小范围，但小于且内含子不如三个新注释的小菇属物种丰富（265,249–273,121 bp；45–53个内含子）。值得注意的是，*Mycena arcangeliana*拥有最大的基因组（273,121 bp）和较高的内含子数（51），而*Schizophyllum commune*（49,704 bp）和*Lyophyllum decastes*（50,643 bp）完全无内含子。在分析的物种中，灵芝属物种表现出中等基因组大小（60,635–119,803 bp）和11–30个内含子，而蜜环菌属物种和*Desarmillaria tabescens*（93,439–122,167 bp）包含13–30个内含子。*Tricholoma saponaceum*（94,261 bp）和*Pleurotus platypus*（73,807 bp）各含9个内含子，而蜡蘑属物种（65,156–95,304 bp）含8–10个内含子。
3.5 伞菌目线粒体基因组的内含子动态
cox1基因在物种间表现出显著的内含子含量变异，从零内含子（*Schizophyllum commune*和*Lyophyllum decastes*）到20个内含子（*Clavaria fumosa*）。杨树桑黄cox1内含12个内含子，是检查物种中内含子最丰富的cox1基因之一。某些内含子插入位点在系统发育远缘物种间显得高度保守。例如，P703在*Lyophyllum shimeji*、*Laccaria bicolor*、*Agaricus bisporus*、*Pleurotus platypus*和*Clavaria fumosa*中鉴定到，而P609在*Lyophyllum shimeji*、*Tricholoma saponaceum*、*Agaricus bisporus*、*Pleurotus platypus*和*Hygrophorus russula*中检测到。这些系统发育保守的插入位点暗示某些内含子可能遗传自共同祖先或在谱系间频繁转移。相反，许多内含子位置是谱系特异性的。例如，杨树桑黄具有几个独特的cox1内含子（P237、P276、P510、P567、P597、P672、P729、P801、P891、P918、P978、P1062），均未与其他物种共享，表明杨树桑黄分化后广泛的谱系特异性内含子获得。类似地，三个灵芝属物种共享几个内含子位置（如P706、P864、P923、P1302），同时表现出物种特异性差异。除cox1外，内含子还分布于其他核心PCGs，包括atp9、cob、cox2、cox3、nad1、nad2、nad4和nad5。然而，这些基因内含子的数量和分布通常低于cox1，许多物种在某些基因中完全缺乏内含子。cob基因构成第二最频繁的内含子宿主，插入位点如P201、P378、P393、P429和P820在多个物种中鉴定到。在杨树桑黄内，cob含八个内含子，使其成为仅次于cox1的内含子最丰富基因。cox2基因在几个物种中也含多个内含子，特别是在杨树桑黄（七个内含子）、蜜环菌属物种和*Clavaria fumosa*中。值得注意的是，某些物种在其他核心基因中表现出异常低的内含子含量。*Pleurotus platypus*和*Hygrophorus russula*在检查的任何其余核心PCGs中缺乏内含子，而*Schizophyllum commune*和*Lyophyllum decastes*在cox1和其他核心基因中均无内含子。相比之下，*Clavaria fumosa*在所有核心基因中显示最高的内含子含量，内含子分布于atp9、cob、cox2、cox3、nad1、nad2、nad4和nad5。对所有153个预测ORFs的Pfam扫描鉴定出13个携带显著归巢内切酶（HEG）结构域的ORFs（E < 1 × 10??）：四个ORFs（ORF108、ORF24、ORF27和ORF101）同时含有GIY-YIG（PF01541）和LAGLIDADG_2（PF03161）特征，九个ORFs（ORF60、ORF20、ORF119、ORF42、ORF98、ORF73、ORF58、ORF22和ORF59）含有LAGLIDADG_1（PF00961）特征。
3.6 杨树桑黄在伞菌目内的系统发育位置
为确定杨树桑黄在伞菌目内的系统发育位置，使用来自24个代表性物种的14个核心PCGs的串联核苷酸序列重建了ML系统发育。三个灵芝属物种（*G. meredithae*、*G. lucidum*和*G. applanatum*）形成强烈支持的单系群（BS = 100%），作为其余伞菌目物种的外群，与本分析中使用多孔菌目作为远缘外群为伞菌目系统发育定根一致。在内群中，一个大的包容性分支（BS = 87%）包含蜜环菌属物种、*Moniliophthora roreri*、*Schizophyllum commune*、四个小菇属物种和杨树桑黄。在此分支内，四个小菇属物种（*M. galericulata*、*M. inclinata*、*M. arcangeliana*和*M. pura*）形成强烈支持的单系群（BS = 100%）。值得注意的是，杨树桑黄被恢复为此小菇属分支的姐妹谱系，尽管支持度较弱（BS = 49%）。此姐妹关系表明杨树桑黄与小菇属系统发育上近缘，与其靠近小菇科的位置一致。其他支持良好的分支包括*Lyophyllum*–*Tricholoma*分支（BS = 100%），包含*L. decastes*、*L. shimeji*和*Tricholoma saponaceum*；*Laccaria*–*Gymnopilus*–*Agaricus*分支（BS = 97%），其中两个蜡蘑属物种形成亚分支（BS = 100%）与*Gymnopilus junonius*（BS = 91%）为姐妹，然后与* Agaricus bisporus*；以及*Pleurotus*–*Hygrophorus*–*Clavaria*分支（BS = 100%），*Pleurotus platypus*作为*Hygrophorus russula* + *Clavaria fumosa*谱系的姐妹分化。蜜环菌属分支（BS = 100%）包含*A. borealis*、*A. solidipes*、*A. sinapina*和*Desarmillaria tabescens*，*D. tabescens*作为三个蜜环菌属物种的姐妹分化。值得注意的是，ML树拓扑与基因排序比较和内含子分布模式显示出实质性一致。共享相似基因排序和内含子组成的物种——如三个蜜环菌属物种和三个灵芝属物种——在系统发育中一致聚在一起，从而加强了源自线粒体基因组架构的进化信号。
4 讨论
4.1 杨树桑黄线粒体基因组的基因组架构和扩张
本研究表征的杨树桑黄完整线粒体基因组由一条248,416 bp的环状DNA分子组成。此大小超出大多数伞菌目物种报道的典型线粒体基因组大小范围（40–120 kb）。然而，此处检查的几个物种具有更大的线粒体基因组。在研究人员的数据集中，三个新注释的小菇属物种——*M. arcangeliana*（273,121 bp）、*M. inclinata*（272,062 bp）和*M. galericulata*（265,249 bp）——在大小上超过杨树桑黄。*Clavaria fumosa*（256,807 bp）和*Morchella importuna*（272 kb）也大于杨树桑黄。杨树桑黄含40个内含子，而三个小菇属物种含45–53个内含子。杨树桑黄线粒体基因组的基因组成符合真菌线粒体基因组的经典组织，包含14个参与氧化磷酸化的保守PCGs、两个rRNA基因和34个tRNA基因。保留15个PCGs（包括rps3）和153个ORFs进一步促进该线粒体基因组的基因组复杂性。rps3基因编码核糖体蛋白S3，普遍分布于真菌线粒体基因组中，已被确立为提供真菌线粒体基因组进化轨迹宝贵见解的祖先基因。其在杨树桑黄中的存在与其在担子菌门中的广泛分布一致。杨树桑黄线粒体基因组的显著AT富集组成（GC含量 = 28.02%）是真菌线粒体基因组的特征。这种强AT偏好体现在密码子使用谱中，其中以A或U结尾的密码子在所有PCGs中被优先使用。 favoring AT富序列的突变压力代表真菌线粒体基因组的普遍特征，归因于线粒体内升高的突变率和偏倚的DNA修复机制。杨树桑黄中观察到的密码子使用偏好与其他伞菌目物种记录的模式类似，表明突变压力和自然选择共同塑造了整个目内的密码子使用景观。排除NUMT污染对杨树桑黄尤为关键，因为其线粒体基因组为248,416 bp、AT富集（GC 28.02%）且从总基因组DNA组装。长HiFi reads、均匀覆盖验证和核基因组比较的组合为组装线粒体基因组的真实性提供了强有力的信心。此质量控制框架应常规应用于未来真菌线粒体基因组研究，特别是对具有扩张的AT富集线粒体基因组的物种。
4.2 内含子动态及其进化意义
杨树桑黄线粒体基因组最显著的特征之一是其异常升高的内含子含量。含40个内含子分布于多个基因——包括cox1内12个——杨树桑黄拥有伞菌目物种中内含子最丰富的线粒体基因组之一。本研究中鉴定的内含子数与基因组大小之间的强正相关确认内含子增殖构成伞菌目中線粒体基因组扩张的主要驱动因素， corroborating 其他真菌谱系的先前发现。杨树桑黄的内含子负荷显著高于Tricholoma物种（1–29个内含子）和Laccaria物种（8–10个内含子）记录的水平，凸显了整个目内内含子动态的广泛变异。cox1基因构成杨树桑黄线粒体基因组内内含子的主要储库，含12个内含子分布于不同位置类别。此观察与cox1作为真菌线粒体基因组中最内含子丰富宿主基因的既定角色一致。cox1内含子在伞菌目物种间的分布揭示出以谱系特异性获得和丢失事件为特征的复杂进化模式。某些内含子位置，特别是P609和P703，在系统发育远缘物种间广泛分布，暗示祖先遗传或频繁水平转移。相反，杨树桑黄内许多内含子位置似乎是分类单元特异性的，表明该谱系分化后广泛的内含子获得。这种内含子进化的动态模式与"Aenaon模型"一致，该模型认为内含子及其相关归巢内切酶经历协调共进化，从而促进线粒体基因组多样化。Huang等人证明Tricholoma线粒体基因组中的内含子经历了频繁的丢失/获得事件，而Li等人记录了Laccaria物种cox1内含子中的类似动态，共同表明内含子移动性构成整个目中广泛存在的现象。内含子编码ORFs的存在构成杨树桑黄线粒体基因组的显著特征。这些移动遗传元件被假设通过归巢机制促进内含子转座，使内含子能够侵入基因组内和基因组间的新插入位点。杨树桑黄线粒体基因组含41个内含子ORFs，对所有153个预测ORFs的Pfam扫描鉴定出13个携带可识别归巢内切酶结构域的ORFs（E < 1 × 10??），包括四个同时具有GIY-YIG（PF01541）和LAGLIDADG_2（PF03161）特征的ORFs和九个具有LAGLIDADG_1（PF00961）特征的ORFs。此生物信息学证据为HEG介导的归巢促进了该线粒体基因组内含子动态的推断提供了直接支持，且与内含子集中于cox1、cob和cox2一致。由于HEG活性未经实验测试，此解释仍为推断性的，应在未来功能研究中验证。跨伞菌目物种记录的反复内含子获得和丢失事件，包括杨树桑黄独特的内含子组成，共同凸显了真菌线粒体基因组内内含子进化的动态和持续性质。有趣的是，其他核心PCGs中内含子的分布比cox1中观察到的要受限得多。尽管cob和cox2在某些物种中含多个内含子，基因如atp8和nad4L在所有检查的伞菌目分类单元中保持完全无内含子。这种异质分布表明特定基因表现出更大的内含子插入许可性，可能由于其结构特征或功能约束。atp8和nad4L在伞菌目中普遍缺乏内含子可能反映针对能够破坏这些不可或缺呼吸链组分功能的插入的严格纯化选择。
4.3 基因排序重排和基因组可塑性
比较基因排序分析揭示杨树桑黄具有独特的基因组排列，使其区别于本研究中检查的所有其他伞菌目物种。线性基因排序rrn23-cox3-atp8-nad2-nad3-atp9-rrn16-cox1-cox2-nad6-nad4L-nad5-nad4-rps3-cob-nad1-atp6似乎是谱系特异性的，暗示杨树桑黄在其进化历史中经历了广泛的基因组重排。基因重排构成真菌线粒体基因组进化的标志。伞菌目物种间观察到的基因排序显著变异，即使在同属内，表明线粒体基因组高度可塑且易受频繁重组事件影响。在杨树桑黄中，非典型基因排序可能起源于由重复序列介导的重组事件，重复序列在该线粒体基因组中丰富。976个重复序列（465个SSRs、216个串联重复和295个散在重复）的存在为重组介导的基因组重排提供了充足的潜在底物，且杨树桑黄的谱系特异性基因排序与此可能性一致。然而，重复介导的重组在此未被直接证明，与*Taiwanofungus camphoratus*的比较仅提供间接类似物。因此，研究人员将重复介导的重组解释为合理假设而非既定机制；直接证据将需要实验重组测定或群体水平和长读长测序数据，这超出本研究范围。尽管存在广泛重排，某些基因簇表现出比其他基因簇更大的进化稳定性。cox3-nad4L-nad5和nad2-nad3在多个物种中的反复邻接暗示存在保持这些空间关联的功能或进化约束。这些保守基因簇可能反映共调控的转录优势或呼吸链复合体高效组装所需的物理邻近。这些簇在伞菌目中的保留，尽管其他基因组区域存在广泛重排，凸显了维持特定基因排序对 proper 线粒体生物发生和功能的功能必要性。
4.4 进化选择和核苷酸分歧
选择压力分析表明杨树桑黄线粒体基因组内所有15个PCGs（14个核心PCGs加rps3）主要受纯化选择作用（Ka/Ks < 1），此发现与这些基因在氧化磷酸化中不可或缺的功能角色一致。其中，cox1、cox2、cob、nad4、nad5和nad4L表现出最显著的纯化选择，反映细胞色素c氧化酶亚基和NADH脱氢酶在电子传递链中的关键生化功能。对这些基因施加的严格功能约束与其在真菌中的高度进化保守性及对细胞能量代谢的必要贡献一致。类似的纯化选择模式已在其他伞菌目物种中记录，包括Tricholoma和Laccaria，表明这些基因在整个目中受强有力的进化约束。rps3基因在所有检查基因中表现出最高的Ka/Ks值，某些成对比较超过1.0，尽管均未达到统计学显著性。此升高比值可能反映宽松的选择约束，或不太可能为初期正选择，但当前信号在统计学上较弱，应视为初步的。还值得注意的是，rps3在真菌线粒体基因组中常位于内含子或rRNA区域附近，且已知比核心呼吸链基因更易分歧，这可能部分解释其升高的Ka/Ks。作为线粒体核糖体的组分，核糖体蛋白S3可能由于差异功能需求或与核编码核糖体蛋白的共进化相互作用而经历相对于呼吸链基因不同的进化动态。然而，正式的选择测试和与核编码核糖体蛋白基因的直接比较超出本研究范围，应在未来工作中以更广泛的分类单元取样和转录水平数据加以解决。核苷酸分歧（Pi）分析鉴定atp6、cox3和nad5为最具多态性的基因，而atp8作为最进化保守的位点出现，紧随其后的是nad4L。atp6、cox3和nad5的升高变异性表明它们作为杨树桑黄内或系统发育近缘物种群体遗传学研究分子标记的潜在效用。相反，atp8和nad4L的显著保守性使其适合作为更深分类阶元系统发育推断的候选。杨树桑黄线粒体基因组内高变和高度保守基因的表征为这一具有商业重要性物种内群体遗传学和菌株分化的未来研究奠定了基础。
4.5 系统发育位置和进化意义
基于串联线粒体PCGs的系统发育分析将杨树桑黄恢复为小菇属分支的姐妹谱系，但此关系仅获得弱bootstrap支持（BS = 49%）。因此，研究人员将姐妹于小菇属的位置解释为暂定假设而非既定关系。鉴于仅有单一桑黄科代表（杨树桑黄）可用，此弱支持并不意外，桑黄科和小菇科内更广泛的分类单元取样以及额外的分子标记将是解决杨树桑黄科级关系所必需的。值得注意的是，线粒体系统发育与基因排序和内含子分布模式显示出实质性一致，从而加强了源自线粒体基因组架构的进化信号。系统发育基因组学和结构基因组数据之间的这种一致性凸显了线粒体基因组特征作为进化研究补充分子标记的效用。杨树桑黄靠近小菇属分支的位置与当前基于ITS/nrLSU的桑黄属及其近缘多 locus 框架大致一致，尽管姐妹关系的弱支持（BS = 49%）排除了本研究中线粒体和核拓扑之间正式一致性检验的可能性。与ITS/nrLSU衍生关系的直接比较将需要重新分析相同分类单元集的核标记，因此被确定为未来工作的优先事项。在此类分析可用之前，此处呈现的线粒体树应被视为独立的证据线，定性地与既定多 locus 分类一致，但不是其替代。杨树桑黄的系统发育位置尤为相关，因为桑黄科的线粒体基因组资源此前完全缺失，而近缘小菇科仍稀缺。在本研究之前，唯一发表的小菇科线粒体基因组是*Mycena pura*，加上此处新注释的三个小菇属线粒体基因组，杨树桑黄/小菇属分组的可用线粒体基因组资源已有效扩展数倍。杨树桑黄与小菇属物种之间在基因组大小、内含子含量和基因排序方面的显著差异凸显了此分组内广泛的基因组多样性，并强调需要更广泛的线粒体基因组取样。最近其他伞菌目科的线粒体基因组贡献，包括*Nidula shingbaensis*（Nidulariaceae）和*Singerocybe alboinfundibuliformis*（Clitocybaceae），共同确认了线粒体PCGs用于解析伞菌目系统发育关系的效用。Sarhan等人开展的大规模线粒体基因组组装计划成功从2695个真菌物种重建线粒体基因组，几乎使真菌界内记录的线粒体基因组多样性增加两倍。然而，小菇科在该数据集中仍严重取样不足，仅包含*M. pura*。本研究通过提供桑黄科（杨树桑黄）的首个高质量参考线粒体基因组并新注释三个额外小菇科线粒体基因组（*M. galericulata*、*M. inclinata*和*M. arcangeliana*）部分填补了此空白。杨树桑黄线粒体基因组的独特特征——包括其扩张的大小、升高的内含子含量和非典型基因排序——为这一分类学上未被充分探索的科内线粒体基因组进化动态提供了宝贵见解。
4.6 比较见解和未来展望
杨树桑黄线粒体基因组的全面表征为伞菌目内线粒体基因组的进化轨迹提供了重要见解。杨树桑黄中观察到的显著基因组扩张主要由基因间区和内含子的增殖驱动——此模式日益被认为是扩大真菌线粒体基因组的定义特征。以内含子获得和丢失事件反复为标志的内含子进化动态性质对伞菌目物种间记录的基因组多样性有重大贡献。杨树桑黄线粒体基因组的内含子丰富架构，特别是cox1内的12个内含子，将该物种定位于迄今表征的内含子多样性最丰富的伞菌目线粒体基因组之列。杨树桑黄线粒体基因组的非典型基因排序和广泛重复元件含量凸显了真菌线粒体基因组的显著可塑性。重复序列的丰度，包括SSRs和散在重复，为可能促进真菌中线粒体基因组加速进化的重组介导重排提供了潜在底物。然而，重复介导的重组在本研究中未被直接证明，推断仍为间接的，依赖于丰富重复和谱系特异性基因排序的共现。这些结构特征可能额外对线粒体基因组的稳定性和母系遗传及其与核基因组的共进化相互作用产生影响。杨树桑黄线粒体基因组的重复丰富组成与重组事件在塑造其当前基因组架构中作用的可能性一致，但不能证明，类似于其他重复密集真菌线粒体基因组中的观察；直接证据将需要实验重组测定或群体水平和长读长测序数据。从线粒体PCGs推断的杨树桑黄系统发育位置与现行分类分类大致一致，但其与小菇属姐妹关系的弱支持（BS = 49%），加上仅包含单一桑黄科代表，意味着其在伞菌目内的精确位置仍未解决。然而，伞菌目系统发育内某些更深节点恢复的有限bootstrap支持暗示额外分子标记或扩大分类单元取样可能是完全解析这一多样化目内进化关系所必需的。由高通量测序技术和计算组装方法学进步促进的不断扩大的线粒体基因组数据仓库无疑将有助于对真菌线粒体进化更全面的理解。进一步的方法学考虑是，此处使用的注释策略虽然适当且精心策划，但依赖于计算机预测。BLAST搜索、tRNAscan-SE、具有102 bp阈值的ORF Finder以及在遗传密码4下的人工策划非常适合真菌线粒体基因组注释，且新注释的小菇属基因组的multi-exon CDS边界通过多序列比对检查。然而，计算机剪接预测无法检测RNA编辑，且本研究中报告的外显子-内含子边界，包括三个新注释的小菇属线粒体基因组的边界，是从序列比对推断的而非实验验证的。通过RT-PCR的实验验证在本研究中不可行，因为杨树桑黄中大多数线粒体基因>2.5 kb且具有高度AT富集的末端区域，使引物设计困难；缩短外显子只会产生部分片段且无法验证全长剪接。因此，一旦转录水平数据可用，某些剪接位点或编码边界可能需要修订。未来使用RNA-seq、直接RNA测序或针对AT富集模板优化的全长cDNA扩增的工作将是实验确认剪接位点并评估杨树桑黄及其近缘中潜在RNA编辑所必需的。在此类数据可用之前，此处呈现的注释应被视为一个支持良好的框架和后续功能和转录组研究的可检验假设。
5 结论与展望
总之，本研究提供了杨树桑黄线粒体基因组的首个全面表征，一个248,416 bp的分子，具有广泛的内含子含量、独特的基因排序和丰富的重复元件。它填补了桑黄科线粒体基因组数据的关键空白，并与三个新注释的小菇属线粒体基因组一起，大幅扩展了目前杨树桑黄/小菇属分组可用的线粒体基因组资源。系统发育分析将杨树桑黄恢复为小菇属分支的姐妹谱系，但支持度较弱（BS = 49%）；因此该位置应被视为暂定的。杨树桑黄与*Mycena pura*之间在基因组大小、内含子含量和基因排序方面的显著差异凸显了在桑黄科和其他代表性不足的科内扩大线粒体基因组取样的需要，以阐明跨伞菌目的进化动态。未来研究应优先考虑几个具体步骤：基于PCR验证环状连接处和内含子边界；对内含子ORFs进行RNA-seq以测试其表达和潜在功能；群体水平线粒体基因组取样以测试此处鉴定的基于atp6、cox3和nad5的标记的效用；以及在multi locus系统发育中纳入额外的桑黄科分类单元。扩大桑黄科内的分类单元取样尤为重要，因为杨树桑黄目前是该科唯一具有完整线粒体基因组的代表。此处呈现的杨树桑黄参考线粒体基因组将作为这些未来真菌线粒体进化和系统发育研究的宝贵资源。
