《Cell Reports》：Rheb in central amygdala somatostatin neurons regulates chronic itch and anxiety-like behaviors
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慢性瘙痒是一种重大临床挑战，严重损害患者的生活质量，但其潜在的神经环路与分子机制仍不清楚。研究人员证明，中央杏仁核（central amygdala, CeA）中表达生长抑素（somatostatin, SST）的神经元在二苯基环丙烯酮（diphenylcyc
慢性瘙痒是一种重大临床挑战，严重损害患者的生活质量，但其潜在的神经环路与分子机制仍不清楚。研究人员证明，中央杏仁核（central amygdala, CeA）中表达生长抑素（somatostatin, SST）的神经元在二苯基环丙烯酮（diphenylcyclopropenone, DCP）诱导的慢性瘙痒小鼠模型中被激活且为慢性瘙痒相关行为表现所必需。转录组分析进一步揭示，在DCP-TRAPed CeA SST神经元中，脑富集型Ras同源物（Ras homolog enriched in brain, Rheb）表达上调。值得注意的是，Rheb敲低抑制了CeA SST神经元的超兴奋性（hyperexcitability），并缓解了DCP处理小鼠的慢性瘙痒相关抓挠与焦虑样行为。相反，Rheb过表达促进了naive小鼠的抓挠与焦虑样行为。综上所述，这些发现描绘了一种Rheb调控的CeA SST神经元机制，该机制参与慢性瘙痒相关抓挠与焦虑样行为，为慢性瘙痒的治疗干预提供了潜在分子靶点。
本论文由Sun Yat-sen University Cancer Center的Xie实验室与ShanghaiTech University的Hu实验室合作完成。慢性瘙痒（chronic itch，定义为持续六周以上的瘙痒）与皮肤、系统、神经系统疾病及恶性肿瘤相关，严重损害患者生活质量且缺乏靶向治疗策略，存在巨大未满足医学需求；其关键临床特征是与焦虑形成相互加剧的恶性循环。尽管瘙痒外周与脊髓机制研究取得显著进展，驱动慢性瘙痒及伴随焦虑的中枢神经环路与分子通路仍不清楚。中央杏仁核（central amygdala, CeA，整合感觉信息与情绪、动机处理的关键边缘系统枢纽）主要由含PKCδ、SST、CRH等亚群的GABA能神经元构成，并参与躯体感觉加工，但其调控慢性瘙痒及相关焦虑的机制未知。Ras homolog enriched in brain（Rheb，脑富集型Ras同源物，一种小GTP酶）是雷帕霉素机制靶蛋白复合体1（mechanistic target of rapamycin complex 1, mTORC1）的关键上游激活因子，持续激活可破坏神经元稳态、促进超兴奋（hyperexcitability）与感觉过敏，但其在慢性瘙痒中枢调控中的作用未知。
针对上述问题，研究人员以二苯基环丙烯酮（diphenylcyclopropenone, DCP）诱导的慢性瘙痒小鼠模型为对象，鉴定出CeA中SST神经元在慢性瘙痒相关抓挠与焦虑样行为中被激活且功能必需；转录组分析揭示Rheb在DCP-TRAPed CeA SST神经元中上调；敲低Rheb抑制其超兴奋性并缓解症状，过表达则在naive小鼠中促进抓挠与焦虑样行为，为慢性瘙痒治疗提供了细胞类型特异性和分子靶点。
研究采用的关键技术与样本队列如下：以DCP涂抹建立慢性瘙痒（过敏性接触性皮炎）模型，样本为8-12周龄C57BL/6J小鼠（除雌性小鼠行为学实验外均为雄性）；利用4-羟基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen, 4-OHT）诱导的FosTRAP（活动依赖遗传标记）捕获慢性瘙痒相关神经元集群，结合单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）开展转录组分析；通过离体脑片全细胞膜片钳记录（patch-clamp）检测神经元兴奋性；以光纤光度记录（fiber photometry）在体监测CeA Vgat神经元活动；采用化学遗传学（designer receptors exclusively activated by designer drugs, DREADD）操控神经元集群；经立体定位注射AAV病毒实现Rheb的RNA干扰与过表达及投射特异性操控；并运用抓挠行为测试、旷场实验（open field test, OFT）与高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）评估抓挠与焦虑样行为。
研究结果如下：
（1）DCP诱导的慢性瘙痒激活CeA SST神经元并增强其兴奋性。光纤光度记录显示DCP抓挠期间CeA Vgat神经元活动升高；FosTRAP标记与snRNA-seq显示DCP小鼠CeA中TRAPed神经元显著增多，Sst亚群占比由51.3%升至66.7%；膜片钳记录显示CeA SST神经元动作电位发放增加、静息膜电位去极化、基强度降低；化学遗传学抑制DCP-TRAPed CeA神经元显著减少抓挠并缓解焦虑样行为，提示被募集的CeA神经元集群同时参与抓挠与焦虑。
（2）CeA SST神经元调控瘙痒相关抓挠和焦虑样行为。慢性瘙痒小鼠中抑制CeA SST神经元减少自发抓挠，增加OFT中央区与EPM开放臂停留时间而不影响运动；naive小鼠中激活该神经元促进抓挠并增加焦虑样行为；雌性小鼠中抑制同样减少抓挠并缓解焦虑，激活仅增加抓挠而不显著改变焦虑样指标，提示CeA SST神经元对抓挠的调控在两种性别中保守，而对焦虑样行为的调控存在性别依赖性。
（3）转录组分析鉴定DCP-TRAPed CeA SST神经元中Rheb上调。tdTomato+ Sst+神经元差异表达分析鉴定出274个上调基因；基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示其富集于化学突触传递、神经递质受体与突触后信号、AMPA受体转运等与突触功能和兴奋性相关的通路；与活动调节基因（activity-regulated genes, ARGs）交集得到6个候选基因，qPCR（2
?ΔΔCt法）验证仅Rheb mRNA显著上调，Western blot证实Rheb蛋白水平升高。
（4）CeA SST神经元中Rheb敲低降低神经元兴奋性并缓解瘙痒相关行为。AAV介导shRNA细胞类型特异性敲低Rheb后，CeA SST神经元动作电位发放频率显著降低，静息膜电位超极化，基强度升高；DCP小鼠抓挠次数显著减少，OFT中央区与EPM开放臂停留时间显著增加，总运动距离无显著差异，表明Rheb参与维持CeA SST神经元超兴奋状态并调控慢性瘙痒相关行为。
（5）CeA SST神经元中Rheb过表达促进抓挠和焦虑样行为。naive小鼠CeA SST神经元过表达Rheb后自发抓挠显著增加，OFT中央区与EPM开放臂停留时间减少；病毒标记神经元的p-S6（phosphorylated ribosomal protein S6，磷酸化核糖体蛋白S6，mTORC1活性标志物）荧光强度升高，提示mTORC1信号增强；共表达抑制性DREADD hM4Di后进行化学遗传学抑制可消除Rheb过表达引起的抓挠与焦虑样行为，证明Rheb通过调控CeA SST神经元功能发挥作用。
讨论部分指出，本研究通过FosTRAP结合snRNA-seq将CeA的功能拓展至慢性瘙痒调控，证实CeA SST神经元在慢性瘙痒中被募集并呈超兴奋表型，且其对焦虑样行为的调控存在性别依赖性；既往研究显示CeA SST神经元在疼痛加工中的作用因神经元亚群、投射定义的环路和病理情境而异。投射示踪显示CeA SST神经元轴突支配臂旁核（parabrachial nucleus, PBN）与终纹床核（bed nucleus of the stria terminalis, BNST）：抑制投射PBN的神经元减少抓挠而不显著改变焦虑样行为，提示该群神经元优先调控慢性瘙痒相关抓挠；抑制投射BNST的神经元在缓解焦虑样行为的同时减少抓挠，提示该群神经元同时参与抓挠与焦虑。研究结论部分指出，这些发现揭示了一种Rheb调控的CeA SST神经元机制，共同构成慢性瘙痒的感觉成分与情绪成分，为慢性瘙痒及其相关情感障碍的治疗干预提供了潜在靶点。研究同时指出局限：FosTRAP捕获限定时间窗内激活的神经元集群，应视为异质性慢性瘙痒相关集合而非瘙痒特异群体；Rheb过表达后下游分子机制尚不完全清楚；焦虑样行为性别差异的底层机制有待进一步阐明。
