Pot1a维持LepR+间充质干细胞龛功能以支持造血干细胞静息与重建

《Cell Reports》：Pot1a maintains mesenchymal stem cell niche function to support hematopoietic stem cells

　　

造血干细胞（HSCs）通过与骨髓（BM）中龛细胞的相互作用维持其功能。研究人员此前已证明，端粒保护蛋白复合体（shelterin）组分端粒保护蛋白1a（Pot1a）通过抑制DNA损伤应答（DDR）和活性氧（ROS）产生，维持HSCs及表达神经胶质抗原2（NG2⁺）的间充质干细胞（MSCs）。然而，Pot1a在表达瘦素受体（LepR⁺）的MSCs——一种主要HSC龛组分——中的作用仍不清楚。LepR特异性Pot1a敲除小鼠显示LepR⁺ MSCs数量减少、DDR和ROS产生增加、HSC静息性降低以及长期造血重建受损。相反，细胞可渗透性Pot1a增强LepR⁺ MSCs的造血支持功能。Pot1a缺失降低多效蛋白（Ptn）表达，而Pot1a过表达增加其表达。这些发现提示，Pot1a通过限制应激相关改变、维持MSC数量并调节包括PTN在内的造血支持因子表达，从而保持LepR⁺ MSC功能。

研究背景：HSCs具有自我更新和多能性，可分化形成全部造血谱系并终身维持血细胞生成，其功能受骨髓微环境中的龛细胞严密调控。HSC龛由多种基质和血管相关细胞群体构成，包括骨系细胞以及由nestin、NG2和LepR等标记的MSCs群体。其中，LepR⁺ MSCs是成年骨髓龛的主要基质成分，分布于多个骨髓区域，在稳态和应激下参与造血支持。端粒位于染色体末端，由shelterin蛋白复合体保护；POT1（小鼠为Pot1a和Pot1b）是shelterin组分之一，可通过维持端粒稳定和抑制DDR参与细胞功能维持。研究人员此前发现Pot1a通过抑制DDR和ROS产生维持HSC功能，且NG2⁺ MSCs中Pot1a缺失会导致DDR和ROS增加、成骨分化受损、骨骼发育低下及B细胞分化缺陷。但NG2特异性Pot1a敲除小鼠出现出生后早期致死，限制了对成年造血的研究；Pot1a在LepR⁺ MSCs中的作用尚未阐明。因此，该研究旨在通过构建LepR特异性Pot1a敲除小鼠，明确Pot1a在LepR⁺ MSCs及其造血支持功能中的作用，为理解龛细胞维持HSC的分子机制提供依据。

研究人员发现，Pot1a参与维持LepR⁺ MSCs的数量和功能特性，从而支持其维持造血的能力。Pot1a缺失导致LepR⁺ MSCs数量减少，并与骨髓中SCF水平降低相关，可能反映产生SCF的基质细胞减少；同时，残余LepR⁺ MSCs表现出mTOR信号、线粒体活性相关改变、ROS产生增加及Ptn表达降低。研究还鉴定PTN为Pot1a相关候选龛因子，其表达在Pot1a缺失时降低、在Pot1a过表达时增加。此外，细胞可渗透性MTM-Pot1a处理可改善年轻和老年LepR⁺ MSCs的造血支持能力。该研究提示，Pot1a缺失时LepR⁺ MSCs对HSC的支持受损与LepR⁺ MSC数量减少及龛因子水平改变均相关，Pot1a相关通路可能用于增强MSC介导的造血支持。

关键技术方法：研究使用C57BL/6J（CD45.2）、C57BL/6-Ly5.1（CD45.1）、LepR-Cre、Pot1a^flox/flox及Rosa26-loxP-stop-loxP-DTR-tdTomato报告小鼠；构建LepR-Cre; Pot1a^flox/flox小鼠，常规分析12–16周龄，老年分析18–22月龄，部分老年表达分析为90周龄。采用流式细胞术分选LepR⁺ MSCs（CD31^?CD45^?Ter119^?CD51⁺CD140a⁺LepR⁺）和HSCs（Lin^?Sca-1⁺c-Kit⁺CD48^?CD150⁺），结合免疫荧光检测53BP1与TRF1/TRF2共定位、Annexin V凋亡、CellROX ROS、TMRE线粒体膜电位、ATP、RNA-seq/GSEA/qPCR、MSC-HSC共培养、骨髓移植（BMT）及MTM-Pot1a处理。

研究结果：
1. Pot1a缺失导致LepR⁺ MSCs发生DDR和凋亡。通过LepR-Cre与Rosa26-tdTomato报告小鼠杂交验证重组特异性，发现tdTomato表达主要限于骨髓基质群体，造血细胞包括HSCs中极少或检测不到。Pot1a KO小鼠生长正常，体长和体重无变化，但骨髓tdTomato⁺细胞密度降低，LepR⁺ MSCs频率和绝对数显著减少；Annexin V染色显示Pot1a KO LepR⁺ MSCs凋亡比例增加，tdTomato⁺LepR^?基质细胞凋亡也增加。免疫荧光显示Pot1a KO LepR⁺ MSCs中53BP1占核面积比例及53BP1与TRF1共定位比例升高，提示全局和端粒DDR增加。老年Pot1a KO小鼠同样表现为LepR⁺ MSCs频率和数量减少及凋亡增加。结论为Pot1a缺失与LepR⁺ MSCs全局及端粒DDR增加和凋亡增强相关。

2. Pot1a缺失与LepR⁺ MSCs线粒体活性增加及细胞周期进入相关。Pot1a KO LepR⁺ MSCs中ROS水平、线粒体膜电位和胞内ATP显著增加；RNA-seq显示DNA损伤和凋亡相关基因上调，GO分析显示对照组富集生物合成和代谢过程负调控相关条目，KO组富集蛋白定位和运输相关条目，GSEA显示TCA循环相关基因集富集。磷酸化mTOR（pS2448）水平及mTOR相关基因集富集增加；细胞周期分析显示G₀比例降低、G₁比例增加，细胞周期相关基因集富集。分化实验显示Pot1a KO LepR⁺ MSCs成骨分化显著受损，成脂分化无明显影响；GSEA提示成骨相关基因集负富集，qPCR证实成骨标志基因下调；但骨切片中ALP⁺面积、骨髓脂肪及骨衬细胞频率无显著变化。结论为Pot1a缺失伴随线粒体活性、ROS、mTOR信号和细胞周期进入增加，体外成骨分化受损，但稳态骨或脂肪组织组成无明显改变，不足以主要解释造血表型。

3. Pot1a缺失降低LepR⁺ MSCs的HSC支持能力。HSC与Pot1a缺陷LepR⁺细胞衍生培养MSCs共培养后，HSC频率和数量显著低于对照；体内Pot1a KO小鼠HSC中G₀比例降低、HSC频率增加；CMP、GMP和MEP频率不变，CLP显著减少，pre-pro-B、pro-B、pre-B及B细胞显著减少，T细胞和髓系细胞频率不变。BMT显示Pot1a KO来源HSCs供体嵌合显著降低，移植后4个月骨髓总供体细胞和HSC供体比例显著降低，多系分化能力基本保留，早期骨髓归巢无显著差异。老年Pot1a KO小鼠也显示HSC频率增加、CLP减少及长期造血重建能力受损。结论为LepR⁺ MSCs中Pot1a缺失损害HSC静息性和长期重建能力，并影响淋系祖细胞发育。

4. Pot1a通过维持MSC数量和龛因子水平支持LepR⁺ MSC的造血支持功能。LepR⁺ MSCs中Scf和Cxcl12表达不变，但骨髓中SCF蛋白总量显著降低，可能反映LepR⁺ MSCs数量减少。RNA-seq筛选分泌因子相关差异基因，鉴定37个差异表达的分泌因子相关基因，其中PTN因在鼠和人类HSC维持中起作用且富集于LepR⁺ MSCs而受关注；nicheView分析显示Ptn表达富集于骨髓龛内LepR⁺ MSCs。RNA-seq和qPCR显示Pot1a KO LepR⁺ MSCs中Ptn表达降低，Pot1a过表达则增加Ptn表达。重组PTN培养可增加HSC频率和数量；在Pot1a KO MSCs与HSC共培养中加入PTN可增加HSC数量，但仍低于对照MSC共培养。结论为Pot1a缺失引起LepR⁺ MSCs数量减少及残余MSCs的Ptn表达降低等定量和定性改变，可能共同损害龛支持功能。

5. 外源性Pot1a增强LepR⁺ MSCs的造血支持功能。MTM-Pot1a处理年轻LepR⁺ MSCs后，His标签染色确认其胞内定位；免疫染色显示53BP1累积和TIFs降低，ROS水平降低。培养1周后，MTM-Pot1a组保留可检测LepR表达的LepR⁺细胞衍生培养MSCs比例更高，MSC数量增加，Ptn表达增加。与HSC共培养后，MTM-Pot1a处理组HSC频率和数量增加；共培养后BMT显示外周血供体来源细胞嵌合更高，移植后1个月B细胞比例增加，其他谱系及后续时间点无显著差异；移植后4个月骨髓总供体细胞和HSC供体比例增加。结论为外源性Pot1a可减轻LepR⁺ MSCs应激相关改变并增强其造血支持功能。

6. Pot1a处理改善老年LepR⁺ MSCs的造血支持功能。老年LepR⁺ MSCs中DNA损伤和ROS产生增加，Scf、Cxcl12和Ptn mRNA表达降低；老年小鼠LepR⁺ MSCs中Pot1a表达降低。MTM-Pot1a处理老年LepR⁺ MSCs后，全局DNA损伤和TIFs降低，ROS降低；培养1周后LepR表达保留比例组间无显著差异，但MSC数量增加、Ptn表达增加。与HSC共培养后BMT显示，MTM-Pot1a处理组外周血供体嵌合显著更高，供体来源分化细胞群体无显著变化；移植后4个月骨髓总供体细胞和HSC供体比例增加。结论为MTM-Pot1a处理可减轻老年LepR⁺ MSCs年龄相关应激改变，并改善其龛支持功能及共培养HSC的长期重建能力。

讨论部分总结：该研究将Pot1a鉴定为LepR⁺ MSC介导造血支持的重要调节因子。Pot1a通过限制DDR相关应激和线粒体活性相关改变维持LepR⁺ MSC功能；Pot1a缺失减少LepR⁺ MSCs数量并伴随骨髓SCF水平降低，残余MSCs则表现为mTOR信号、线粒体活性相关改变、ROS产生增加和Ptn表达降低，这些定量和定性改变可能共同损害龛功能并导致HSC静息性和长期重建能力降低。与既往NG2-Cre模型相比，LepR-Cre模型在成年期表现出更广泛的造血表型，可能与LepR⁺ MSCs在成年骨髓中分布更广、数量更多以及分析时造血环境更成熟有关。研究进一步将PTN鉴定为Pot1a相关候选龛因子，其表达受Pot1a缺失和过表达调节；既往研究显示PTN可通过PTPRZ激活PI3K/AKT和ERK通路，促进HSC静息和self-renewal。Pot1a缺陷LepR⁺ MSCs中Il7和Il15上调而淋系祖细胞减少，可能反映龛功能受损后的代偿性转录反应，但不足以补偿LepR⁺ MSCs数量减少和功能改变；髓系和红系祖细胞无明显缺陷可能反映LepR⁺ MSC群体异质性及部分减少后其他龛信号或MSC亚群的补偿支持。衰老LepR⁺ MSCs中Pot1a表达降低并伴DNA损伤和ROS累积，外源性MTM-Pot1a可增强老年LepR⁺ MSCs的造血支持功能，提示Pot1a下降可能参与年龄相关龛功能障碍。局限性包括：mTOR信号激活是否因果性参与凋亡、ROS产生或细胞周期进入尚未确定；未直接在体内检测PTN蛋白水平或测试SCF、PTN对造血表型的体内贡献；研究主要聚焦LepR⁺ MSCs；LepR⁺ MSCs在功能共培养前经体外扩增；研究未设计用于评估性别差异；所有功能分析均在小鼠中进行，人类MSCs和POT1中是否适用尚待确定。

研究结论翻译：总之，研究人员的发现提示，Pot1a通过维持MSC数量和调节龛因子水平，支持LepR⁺ MSC介导的造血功能，从而促进HSC静息和长期重建能力。这些结果通过明确Pot1a在成年LepR⁺ MSC介导的造血支持中的作用，拓展了此前关于Pot1a在HSCs和NG2⁺基质细胞中的研究。