《Metabolites》：Identification of Toxicological Targets of Benzo[a]pyrene and Its Metabolite BPDE in Lung Adenocarcinoma Revealed by Integrated Network Toxicology, Machine Learning and Multi-Omics
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背景/目的：苯并[a]芘（BaP）是一种广泛存在的多环芳烃（PAH），由不完全燃烧产生，是公认的环境致癌物，经吸入途径以肺为主要靶器官。其代谢物苯并[a]芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物（BPDE）具有高度遗传毒性；然而，将BaP/BPDE暴露与肺腺癌
背景/目的：苯并[a]芘（BaP）是一种广泛存在的多环芳烃（PAH），由不完全燃烧产生，是公认的环境致癌物，经吸入途径以肺为主要靶器官。其代谢物苯并[a]芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物（BPDE）具有高度遗传毒性；然而，将BaP/BPDE暴露与肺腺癌（LUAD）联系起来的分子机制仍不完全清楚。本研究旨在识别LUAD中与BaP/BPDE相关的致病靶点。方法：研究人员开发了一个整合毒理学框架，结合化学-蛋白质相互作用预测、人LUAD与正常肺组织之间的转录组比较、网络毒理学、可解释机器学习、单细胞和空间转录组学以及分子对接。结果：将化学-蛋白质相互作用预测与转录组数据整合，识别出135个与LUAD相关的推定BaP/BPDE相关靶点。可解释机器学习方法优先筛选出11个核心基因，包括4个潜在的新贡献者：GABRA2、GSTA3、EDAR和MAOB。单细胞和空间转录组分析揭示了所识别基因在LUAD中的细胞类型特异性和空间异质性表达，包括它们在上皮细胞中的优先富集以及在肿瘤、界面和基质区域之间的异质性分布。分子对接进一步提示BaP/BPDE与候选靶蛋白之间可能存在物理相互作用。结论：本研究提供了BaP/BPDE相关分子改变在LUAD中的整合视图，并突出了候选分子靶点，用于未来实验验证和高暴露人群的潜在化学预防。
研究背景方面，肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的首要原因，每年估计有220万新发病例和179万死亡病例。肺腺癌（LUAD）是最常见的组织学亚型。尽管早期检测和治疗策略取得进展，肺癌预后仍然较差，五年生存率约为20%。主要病因包括吸烟和环境污染。流行病学研究一致表明，居住在重污染地区的个体肺癌死亡风险显著高于污染较轻地区。从不吸烟者的肺癌具有独特的组织学和流行病学特征，几乎全部为腺癌。传统观点认为致癌物通过直接DNA损伤诱导肿瘤，但越来越多证据表明许多此类因子在暴露后未在肿瘤中留下可辨的突变特征。苯并[a]芘（BaP）是一种高分子量多环芳烃（PAH），是原型环境致癌物，由有机物不完全燃烧产生，普遍存在于香烟烟雾、汽车尾气、工业排放和热加工食品中。国际癌症研究机构（IARC）将BaP列为1类人类致癌物。既往研究表明BaP可直接与肺泡上皮表面活性物质相互作用，改变表面张力、相行为和界面结构，甚至在各种动物模型中诱导肿瘤发生。具体而言，BaP暴露通过芳烃受体（AhR）调节Twist1和linc00673等通路，促进LUAD细胞的上皮-间质转化和恶性行为。BaP主要由细胞色素P450酶代谢活化，产生各种反应性中间体，其中BPDE被认为是最终致癌代谢物。BPDE通过AhR激活Nrf2-p62轴，通过促进p62-Snail相互作用稳定Snail蛋白，从而诱导上皮-间质转化（EMT）。BPDE还已知形成共价DNA加合物，特别是在鸟嘌呤残基处，导致基因突变和基因组不稳定。因此，BaP和BPDE代表致癌过程的连锁阶段：母体化合物的暴露及其反应性代谢物的效应。然而，这些研究主要集中于个别信号通路或特定细胞模型，BaP/BPDE诱导肺腺癌发展过程中的转录组改变仍未充分表征。研究人员因此将LUAD与正常肺组织之间的转录组比较与预测的BaP/BPDE靶点相结合，以探索这些致癌物与LUAD之间的潜在分子机制。网络毒理学整合化学-蛋白质相互作用、分子网络和疾病表型，为表征外源物质的多效性效应提供了强大框架。当与可解释机器学习相结合时，此类方法能够识别介导毒物诱导疾病的关键分子枢纽和通路，同时保持可解释性和生物学合理性。然而，这些技术很少与网络毒理学和机器学习整合来研究BaP和BPDE相关的肺癌机制。为解决这一关键空白，本研究利用三角系统毒理学框架来描述BaP和BPDE在LUAD中驱动的致病网络。研究人员整合了化学蛋白质相互作用预测、来自人LUAD和正常肺组织的批量转录组分析、基于可解释机器学习的靶点优先级排序以及分子对接分析，以识别BaP/BPDE毒性的关键分子介质。所识别基因的意义通过人类单细胞RNA测序和空间转录组数据进行评估。通过将网络水平推断与空间分辨分子验证相结合，本研究提供了BaP/BPDE诱导肺致癌作用的多尺度视图，并识别了具有风险评估、化学预防和环境暴露人群精准干预潜在相关性的候选分子节点。
研究人员开展的研究得出以下结论：通过ChEMBL和PharmMapper两个互补数据库系统预测BaP和BPDE的潜在生物学靶点，整合结果并去除重复后识别出573个独特的潜在生物学靶点。利用TCGA-LUAD与GTEx队列的转录组数据库筛选LUAD靶基因，通过严格的标准化程序整合基因表达谱以最小化批次效应，PCA确认标准化后数据同质性增强。差异表达基因（DEG）分析揭示5098个在LUAD中表达显著改变的基因。加权基因共表达网络分析（WGCNA）中，软阈值功率（β）优化为近似无标度网络结构，构建拓扑重叠矩阵（TOM），层次聚类识别出八个稳健的基因模块，其中MEturquoise模块与LUAD表型强相关。整合DEG和WGCNA衍生基因得到5677个LUAD相关基因，其中3706个得到两种方法共同支持。通过573个BaP/BPDE生物靶蛋白与3706个LUAD相关基因的交叉分析，识别出135个可能介导BaP/BPDE诱导LUAD的重叠基因。功能注释显示GO分析在膜电位调节和对异源物质刺激的反应等生物学过程中富集最高，细胞组分方面富集于跨膜转运蛋白复合物和单原子离子通道复合物，分子功能主要与单原子离子通道活性和门控通道活性相关。KEGG通路富集分析识别出前十条富集通路，其中神经活性配体-受体相互作用显示最高富集信号。为从135个候选基因中进一步识别核心基因/蛋白质，研究人员开发并系统比较了117个基于机器学习的预后模型，整合多种算法策略。Lasso + RSF模型表现出优越性能，平均C-index为0.697，在TCGA-LUAD队列中实现了表观Harrell's C-index为0.917（95% CI，0.902–0.930）。SHAP分析用于评估Lasso + RSF模型保留基因的贡献（SLC47A1、AKAP12、LDHA、F2、GABRA2、ALDOA、EDAR、TRPA1、MAOB、SLCO1B3和GSTA3）。特征重要性分析显示SLC47A1（SHAP = 0.0440）、AKAP12（SHAP = 0.0420）、LDHA（SHAP = 0.0379）、F2（SHAP = 0.0294）和GABRA2（SHAP = 0.0232）是预测模型的前五位贡献者。所有11个识别基因均表现出稳健的诊断准确性，其中LDHA基因表现出最高性能（AUC = 0.929）。SHAP分解揭示LDHA（?0.11）和SLC47A1（?0.102）作为关键负调节因子，共同将模型的预测评分（f(x) = 0.0723）降至基线期望（E[f(x)] = 0.394）以下。在11个识别基因中，EDAR、GABRA2、GSTA3和MAOB被识别为LUAD发病机制的新贡献者。单细胞RNA测序分析中，经过严格质量控制保留28,674个高质量细胞，UMAP揭示这些细胞聚类为21个不同簇，基于经典标记基因和先前发表的注释分类为八种主要细胞类型：B细胞、循环细胞、上皮细胞、内皮细胞、肥大细胞、髓系细胞、T/NK细胞和成纤维细胞。通过AddModuleScore算法计算并比较不同细胞类型中肿瘤与正常组之间的选定基因评分，在肿瘤样本中循环细胞、内皮细胞、上皮细胞、髓系细胞和T/NK细胞中观察到更高评分，其中上皮细胞差异最显著。对上皮群体重新聚类得到12个不同簇，注释为四种主要上皮亚型包括AT1、AT2、club和纤毛细胞以及恶性上皮群体。使用inferCNV算法的拷贝数变异（CNV）分析确认恶性上皮细胞与其他上皮亚型相比具有显著CNV改变。在11个候选基因中，3个新基因（EDAR、GSTA3和MAOB）和5个已知基因（ALDOA、AKAP12、F2、LDHA和SLC47A1）在上皮细胞群体中检测到表达。恶性细胞与其他上皮细胞相比表现出显著升高的糖酵解相关基因LDHA和ALDOA表达，伴随高比例表达细胞。在非恶性上皮细胞中，纤毛细胞显示MAOB和GSTA3的优先表达。AKAP12相对富集于肺肺泡I型（AT1）细胞，而EDAR在club细胞中显示更高表达。空间转录组分析中，应用SpaCET对10× Visium空间转录组数据进行spot水平去卷积，识别恶性、基质和肿瘤-基质界面区域。基于SpaCET衍生估计和恶性细胞比例阈值0.5，每个LUAD样本被分区为肿瘤、界面和基质区域。11个基因中6个（MAOB、ALDOA、AKAP12、LDHA、SLC47A1和SLCO1B3）被识别为空间转录组数据中的高变特征，显示跨这些区域的空间表达模式。ALDOA和SLC47A1作为代表性LUAD相关基因，在肿瘤中与基质和界面区域相比显示显著升高的平均表达和更高比例表达细胞。AKAP12在基质和肿瘤中相对高于界面区域。SLCO1B3在所有区域总体低表达。LDHA和MAOB也显示在肿瘤组织中优先上调。分子对接研究中，由于缺乏实验确定结构和无置信度（pLDDT）> 90的AlphaFold模型，AKAP12被排除在对接模拟之外。BPDE对接分析显示ALDOA、GSTA3、LDHA、MAOB、TRPA1、SLC47A1和SLCO1B3等蛋白质表现出强结合亲和力，对接能量约为?9.0 kcal/mol。其他候选蛋白（F2、GABRA2和EDAR）显示中等结合能量（约?6.0 kcal/mol）。阳性对照（AHR）和阴性对照（泛素）与BPDE的结合能量分别估计为?7.539和+2.565 kcal/mol。对接构象可视化显示BaP/BPDE可能容纳于MAOB的结合口袋内，预测的相互作用主要由疏水接触稳定，关键氨基酸残基的氢键贡献额外稳定作用。
关键技术方法方面，研究人员获取GSE30219、GSE31210、GSE72094数据集和TCGA-LUAD数据以及GTEx正常肺组织转录组谱，空间转录组（10× Visium）数据来自ArrayExpress数据库（E-MTAB-13530），单细胞RNA测序数据来自NCBI GEO（GSE131907）。使用PharmMapper服务器和ChEMBL数据库进行计算靶点预测。采用WGCNA构建加权基因共表达网络，STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。构建并比较117个基于机器学习的预后模型，整合10种不同ML算法。使用SHAP进行模型解释。AutoDock Vina进行分子对接。Seurat包处理单细胞RNA测序数据，Harmony校正批次效应，inferCNV识别恶性细胞。SpaCET包进行空间区域划分。
研究结果方面，第一，BaP和BPDE靶点的识别：通过ChEMBL（332个靶点）和PharmMapper（261个靶点）整合，去除20个重复条目后识别出573个独特的潜在生物学靶点。第二，LUAD相关靶基因的识别：PCA确认标准化后数据同质性增强，DEG分析揭示5098个显著改变基因，WGCNA识别出八个基因模块，MEturquoise模块与LUAD表型强相关，整合DEG和WGCNA衍生基因得到5677个LUAD相关基因，其中3706个得到两种方法共同支持。第三，BaP/BPDE诱导LUAD中关键基因和通路的识别：135个重叠基因的GO分析显示在膜电位调节和对异源物质刺激的反应等生物学过程中富集最高，KEGG通路富集分析识别出神经活性配体-受体相互作用显示最高富集信号。第四，基于可解释机器学习的BaP/BPDE相关LUAD核心基因识别：Lasso + RSF模型表现优越，SHAP分析识别11个核心基因，其中EDAR、GABRA2、GSTA3和MAOB为新型贡献者，LDHA诊断准确性最高（AUC = 0.929）。第五，LUAD单细胞景观和核心基因评分分析：28,674个高质量细胞聚类为21个簇和八种主要细胞类型，上皮细胞显示最显著的基因评分差异，恶性细胞表现出显著升高的LDHA和ALDOA表达。第六，LUAD空间区室化和核心基因表达模式：11个基因中6个被识别为空间高变特征，ALDOA和SLC47A1在肿瘤区域显著升高。第七，核心LUAD相关靶点与BaP/BPDE的分子对接模拟：多种蛋白质表现出强结合亲和力，MAOB对接显示BaP/BPDE可能容纳于其结合口袋内。
讨论部分总结：网络毒理学能够系统映射化学-蛋白质-疾病相互作用，特别适用于BaP等复杂环境暴露。富集分析揭示这些靶点涉及肿瘤进展、免疫和炎症反应、代谢重编程以及成瘾相关信号。值得注意的是，许多这些通路已独立牵涉BaP诱导的肺病理学。PPI网络提示这些富集通路之间存在潜在串扰，几个枢纽基因可能连接IL-17信号与NF-κB/MAPK激活、趋化因子介导的免疫细胞募集和细胞外基质重塑。这些发现表明BaP/BPDE诱导的肺肿瘤发生可能由多种信号通路之间的协调相互作用驱动，而非单一孤立通路。为从复杂相互作用网络中优先筛选具有生物学意义和临床相关性的靶点，研究人员采用可解释机器学习框架，透明识别出11个对LUAD有贡献的基因。既往研究报道了7个基因（SLC47A1、AKAP12、LDHA、F2、ALDOA、TRPA1和SLCO1B3）参与肺癌。相比之下，EDAR、GABRA2、GSTA3和MAOB尚未在LUAD中研究，但已牵涉其他肺部疾病和癌症，提示其作为LUAD新靶点的潜力。在4个新识别基因中，MAOB因在单细胞和空间转录组数据中的重要性而具有最高优先级的进一步分析价值。肺组织表现出显著的细胞异质性，环境污染物的致癌效应不太可能在肿瘤微环境中的细胞类型或空间生态位之间均匀分布。LDHA和ALDOA在本研究中的跨平台肿瘤相关上调高度一致。相比之下，在scRNA-seq中具有显著细胞类型特异性的基因表现出更复杂的空间模式。BPDE主要已知形成共价DNA加合物，但也参与各种细胞通路的失调。分子对接模拟提示候选蛋白可能与BaP/BPDE直接相互作用。在MAOB中，BPDE和BaP均紧密嵌入MAOB活性腔内。这些结果提示BaP/BPDE可能通过破坏MAOB的门控行为来干扰其功能。通过整合网络毒理学、可解释机器学习和多转录组学，本研究提供了环境诱导肺致癌作用的多尺度视图，并识别了具有潜在转化相关性的候选分子靶点。然而，本研究存在若干局限性：靶点识别依赖于PharmMapper和ChEMBL，可能遗漏BaP/BPDE相关靶点；可用队列无法评估暴露-反应关系或充分评估发现跨多样人群的普适性；基于可用单细胞数据集的细胞水平比较应视为探索性，需要在独立患者队列中验证。未来研究应扩展预测方法和队列规模，纳入多样人群，并关注BaP和BPDE高暴露群体以描绘暴露-反应关系。此外，整合体外和体内模型包括类器官系统和基因工程小鼠模型对于验证基因功能和机制通路至关重要。最后，研究BaP/BPDE暴露肺细胞中的治疗脆弱性，特别是靶向GABRA2、EDAR、MAOB和GSTA3，可能为环境诱导LUAD的化学预防或干预提供新策略。研究结论部分翻译：本研究通过结合网络毒理学、可解释机器学习、分子对接、单细胞测序和空间分辨转录组学，系统描述了苯并[a]芘及其代谢物BPDE与肺腺癌之间的致癌机制。研究人员识别了潜在的暴露相关关键靶点和涉及代谢重编程、免疫和肿瘤进展的失调通路，并优先筛选出11个核心基因。空间和单细胞分析进一步揭示了这些靶点在LUAD微环境中的显著细胞类型特异性和空间异质性。值得注意的是，GABRA2、EDAR、MAOB和GSTA3被识别为LUAD发病机制的潜在新贡献者。这些发现扩展了当前对BaP/BPDE诱导肺致癌作用超越直接遗传毒性的理解，并突出了候选分子节点，用于未来实验验证、暴露知情风险评估以及环境暴露人群的潜在化学预防或治疗策略。
