3D打印低频机械刺激装置的研制及其体外应用的技术验证与初步生物学评价

《Bioengineering》：Design and Validation of a 3D-Printed Low-Frequency Mechanical Stimulation Device for In Vitro Applications

　　

本研究描述了一种自制低成本装置的设计、技术验证与初步生物学评价，该装置用于向培养细胞施加低振幅机械振动。该系统由3D打印PLA部件和由脉宽调制（PWM）模块驱动的微型扬声器（8 Ω，0.5 W）组成。采用数字示波术和快速傅里叶变换（FFT）分析对电激励信号进行验证，确认在致动器机械有效工作范围（约20–90 Hz）内具有稳定的30 Hz基频；同时检测到矩形PWM激励所特有的、位于基频整数倍（60–180 Hz）处的高次谐波成分。在刺激设置（30 Hz，30%占空比）下，位于培养位置的MEMS加速度计记录到的合成加速度为1.04–1.10 g（振动相关成分约为0.04–0.10 g）。将人牙龈成纤维细胞（GF06）培养于35 mm培养皿中，在CO₂培养箱外接受每日振动，并采用MTT法和体外伤口愈合（划痕）实验评价其响应。每日15 min刺激24 h后，振动处理培养物的代谢活性在较低和较高接种密度下分别超过对照约15和25个百分点；然而，这些差异无统计学意义（p = 0.189和p = 0.098）。当改变每日刺激时长时，72 h后MTT信号随刺激时长增加而升高，150、300和450 s分别达到对照的约115%、134%和154%（300和450 s时p < 0.05）。在划痕实验中，450 s刺激在6 h（35.4% vs. 3.4%）和24 h（53.4% vs. 21.2%；p < 0.01）后较对照增加了间隙闭合。在所测试条件下未观察到明显细胞毒性效应。本研究证明了该平台的技术可行性及其引发可测量的、依赖刺激时长的生物学响应的能力，并为未来包括刺激的直接机械表征以及在受控生理条件下开展更大数量独立生物学重复的实验提供了基础。

机械振动是一种在实验室条件下可影响细胞行为的可控物理刺激。在特定频率和振幅范围内施加振动激励，可影响细胞黏附、形态、代谢活性和活力等过程。低频机械刺激的可控施加因此为研究细胞对外部物理力的响应提供了实用实验工具。近期体外研究进一步表明，细胞响应取决于振动信号的频率和幅度，并因细胞类型而异，这凸显了明确且可重复刺激条件的必要性。低振幅机械振动已被研究作为体外非接触式机械刺激方法。既往研究主要集中于间充质干细胞，报道称明确振动参数可影响其增殖与分化。然而，生物学响应高度依赖频率、振幅、暴露时长和系统配置。此外，许多现有振动平台技术复杂、成本高或专为在CO₂培养箱内运行而设计，这可能限制其用于初步实验室研究的可及性。此外，自制实验室装置的刺激参数并不总是得到验证或充分详细报告，缺乏标准化机械剂量使研究间结果比较和实验条件重复复杂化。因此，从技术角度看，需要一种简单且廉价的振动平台，可由广泛可得的3D打印和电子元件制造，允许直接调节刺激频率和强度，可用于无需专用培养箱集成硬件的短时台面暴露，并附有对其激励信号的记录验证。从生物学角度看，口腔领域振动研究主要涉及牙周膜细胞，而关于牙龈成纤维细胞对此类简单装置所提供明确低频振动方案耐受性的信息仍然有限。在近期报道的系统中，Biehl等开发了一种用于声带组织工程的可扩展高通量平台，其中六个压电扬声器驱动无底24孔板下方的聚二甲基硅氧烷波导；该平台通过激光多普勒振动术表征并在CO₂培养箱内运行。Grosman-Dziewiszek等使用由正弦波发生器驱动的低频扬声器在培养箱内以40和100 Hz振动24孔板。这两个系统均设计用于培养箱内长时间运行，并依赖专用信号发生和放大以及激光振动术进行表征；其构建因此需要计划在初步研究中开展短时明确暴露的实验室可能不具备的设备和资源。本研究追求不同且互补的目标：并非高通量或培养箱集成系统，而是提供一种紧凑、低成本的台面装置，用于低频范围内初步机械生物学实验。所提出平台的新颖性在于以下组合：（i）结构完全由3D打印PLA部件制造；（ii）由廉价且商购可得的PWM模块而非实验室信号发生器和音频放大器驱动的再利用微型扬声器；（iii）无需专门仪器即可直接调节频率和占空比；（iv）顶盖可容纳标准35 mm培养皿，用于CO₂培养箱外的短时明确暴露；（v）通过示波术和FFT分析验证激励信号。本装置与既往发表平台主要特征的比较见第5节（表1）。成纤维细胞代表一种机械响应性强且实验稳健的细胞模型。特别是牙龈成纤维细胞表现出稳定生长特性和高代谢活性，使其适合评价细胞对外部机械刺激的耐受性。本研究中，选择人牙龈成纤维细胞（GF06）作为生物学相关模型，因为其自然适应口腔内咀嚼和牙齿功能期间持续存在的机械力和微振动。细胞在标准体外条件下扩增，随后暴露于受控低频振动。牙龈成纤维细胞组织背景和体外工作流程的示意性图示见图1。本研究主要目标是设计并构建一种紧凑、成本有效的振动装置，用于向培养细胞传递低频机械激励并验证其激励信号。此外，使用人牙龈成纤维细胞（GF06）进行初步生物学评价，以评估不同时长振动暴露后的细胞代谢活性和无细胞区闭合（划痕实验），从而补充平台的技术验证。本节描述用于培养细胞受控低频机械刺激的紧凑振动平台的开发和技术实现。设计强调简单性、可重复性、模块化和成本有效性，目标是创建适合实验室条件下初步机械生物学实验的系统。设计主要目标是开发一种功能性强、紧凑且成本有效的振动装置，能够向培养细胞传递受控低频机械刺激。该系统旨在用于标准实验室环境中的实验，并使用体外细胞模型对振动暴露进行初步生物学评价。重点放在简单性、可靠性以及无需复杂仪器即可调节刺激参数的能力上。关键要求包括：在生物学相关低频范围内可重复产生振动；刺激期间培养板的机械稳定性；参数直接调节；模块化架构以支持未来系统升级。系统配置由四个主要功能部分组成：由AC/DC适配器（230 V AC至12 V DC）和DC-DC降压转换器（12 V至9 V DC）组成的主电源级；基于PWM发生器（XY-KPWM）的电子控制单元；功率放大级；基于扬声器的机械致动器。PWM发生器可实现1 Hz至150 kHz频率调节；然而，机械有效范围受致动器物理性质限制。在实践中，在约20–90 Hz范围内实现稳定机械振动，该范围对应于细胞机械刺激研究中常研究的频率。系统通过认证AC/DC适配器（12 V DC）由230 V AC市电供电，随后由可调DC-DC降压转换器为XY-KPWM控制模块和放大级提供稳定9 V DC轨，确保充分致动器激励。振动平台机械结构在SOLIDWORKS 2020中设计并针对增材制造优化。所有结构部件均由PLA使用FFF/FDM 3D打印机（Creality Ender 5 Plus，深圳，中国）制造。设计重点包括：振动致动器稳定固定；培养容器精确且可重复定位；内部电子元件保护；足够结构刚度以最小化寄生阻尼。振动顶板（图2）作为振动致动器与培养容器之间的主要机械接口。设计容纳直接位于振动元件上方的35 mm培养皿。该配置实现致动器膜片与培养容器支撑之间的直接机械耦合，最小化能量损失并确保低频机械刺激有效传递至细胞培养表面。装置通过AC/DC适配器和DC-DC降压转换器由230 V AC市电供电，提供由摇臂开关（KCD1）切换的稳定9 V DC轨。XY-KPWM控制模块调节激励信号，从而实现振动强度调节。调制信号由基于NE529的放大级放大，该放大级由稳定9 V DC轨供电，以为振动致动器提供足够功率（图3）。微型动态扬声器被再利用为振动致动器。该无品牌扬声器标称阻抗为8 Ω，额定功率为0.5 W，总直径为36.2 mm，总深度为20.8 mm，障板开孔直径为32.0 mm。由于没有制造商频率响应数据，约20–90 Hz的机械可用频率范围通过实验确定（第2.2节）。代替声输出，利用膜片位移产生受控低频机械振荡。电子架构为模块化，允许直接更换单个组件。内部组件容纳于定制设计外壳内（图4），该外壳保护敏感电子元件免受外部污染，同时保持充分通风。可拆卸顶盖（图5）作为振动组件的结构接口。其确保培养容器在X–Y平面内的可重复定位，并限制振动暴露期间不希望的横向位移。振动致动器机械耦合至该组件下侧，而顶盖为振动板提供必要对准，减少阻尼效应并提高传递效率。顶盖为35 mm培养皿提供三个位置。在本文报道的实验中，仅使用直接位于致动器上方的中心位置，两个相邻位置保持空置。由于致动器总直径（36.2 mm；第2.3.1节）与35 mm培养皿直径相当，置于中心位置的培养皿同心位于致动器上方。所有结构部件均使用FFF/FDM 3D打印技术在Creality Ender 5 Plus打印机上制造。结构部件在构建板上的虚拟布局和取向在切片软件内优化，以确保结构完整性和表面质量（图6）。选择PLA丝材是由于其尺寸稳定性、易打印性以及对低振幅振动应用足够的机械刚性；可比的开源和3D打印解决方案已被证明适合定制实验室仪器。部件由直径1.75 mm的PLA丝材使用0.4 mm喷嘴、0.2 mm层高、三个周壁（壁）和20%填充，在200 °C喷嘴温度和60 °C床温下打印；部件的打印取向见图6。报告这些参数是因为FFF打印部件的有效刚度及因此的动态响应取决于壁和填充配置。外壳几何形状经优化以确保电子组件和致动器对准的安全集成。该装置仅由廉价商购电子模块和少量PLA丝材构建，这保持材料成本低，并允许在可使用标准桌面3D打印机的实验室中复制该装置。制造后，将螺纹嵌件压入指定安装点，并在最终组装前对电子组件进行电气验证。然后根据设计布局将所有组件集成到外壳中。为增强内部电子元件保护，内部接缝使用透明硅酮密封，提供对意外液体暴露的基本抵抗力。完全组装的振动装置见图7。为进行详细时域和频域分析，使用具有快速傅里叶变换（FFT）功能的数字示波器OWON XDS3104E（Fujian Lilliput Optoelectronics Technology Co., Ltd.，漳州，中国）。测量主要目标是验证脉宽调制（PWM）发生器（型号XY-KPWM）产生的激励频率稳定性，并确认输出信号的频谱特征。这些测量表征供给致动器的电激励信号；其本身并不量化传递至培养容器的机械振动。生物实验中使用的机械刺激参数见第3.2节，与缺乏完整机械表征相关的局限性在第5节讨论。该信号主要设计用于为振动致动器供电，该致动器代表生物医学实验中使用的典型感性负载——特别是用于刺激牙龈成纤维细胞。记录在精确限定参数下进行以匹配初步生物实验要求：工作频率固定为30 Hz；占空比30%（对应于生物实验中使用的“30%装置输出”设置；第3.2节）；速率10 kS/s；水平分辨率（FFT）25 Hz/div；垂直刻度（FFT）10 dBVrms/div（对数）。显示的时域波形（由示波图上的黄色迹线表示）清楚表现出PWM信号典型的开关特征，其中矩形脉冲宽度对应于预定义调制。测得的时域波形和相应频谱见图8。相应频谱（红色迹线）确认信号明显由所需基频主导。使用精确光标测量，该基频成分被准确验证在30 Hz。除承载系统有用功率最大部分的该基频谐波外，频谱逻辑上揭示存在额外离散频率成分。这些由基频倍数处的局部最大值组成；具体而言，记录到显著峰值位于：60 Hz（第2谐波）；90 Hz（第3谐波，?x = 90 Hz）；120 Hz、150 Hz和180 Hz（第4、5和6谐波）。这些测量确认控制电子器件一致产生具有稳定30 Hz基频的激励信号。承载信号功率最大部分的基频成分以及第2和第3谐波（60和90 Hz）位于致动器产生稳定机械振动的约20–90 Hz范围内（第2.2节）。相比之下，在120、150和180 Hz检测到的高阶谐波位于该范围之上。这些成分的存在是矩形PWM激励的预期结果。由于致动器的机械有效范围有限，高阶成分在传输的机械振动中可能被衰减；然而，这不能仅从电测量确认，谐波成分机械传递至培养容器的程度仍有待直接机械测量确定（第5节）。20–90 Hz范围对应于细胞机械刺激研究中常研究的频率。因此，示波器数据记录电激励参数，并为未来实验中验证刺激设置一致性提供参考。在振动平台技术验证后，进行初步生物实验以初步评估培养细胞对受控低频机械刺激的响应。选择人牙龈成纤维细胞作为实验模型有几个原因。首先，牙龈成纤维细胞在体内暴露于口腔内咀嚼和牙齿功能期间的机械负荷和微振动，这使其成为研究对外部机械刺激耐受性的生理相关模型。其次，其表现出稳健生长特性和高代谢活性，这对涉及培养箱外每日重复操作的初步研究有利。第三，人牙龈成纤维细胞常用于口腔环境材料和医疗器械的体外评价，并且机械刺激在牙周研究中日益受到考虑；因此所选模型将本平台与该领域潜在未来应用联系起来。GF06培养物被特别选择是因为其在合作单位科希策Pavol Jozef ?afárik大学理学院生物物理系细胞培养实验室中常规维持，具有标准化培养条件和常规支原体检测（第3.1节），这确保了本初步研究中细胞处理明确。振动暴露后的细胞代谢活性使用MTT法评估，刺激对无细胞区闭合的影响使用体外伤口愈合（划痕）实验评价。所有实验中使用由科希策Pavol Jozef ?afárik大学理学院生物物理系细胞培养实验室提供的人牙龈成纤维细胞（GF06）。细胞常规维持于高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，补充10%胎牛血清（FBS）、青霉素（50 μg/mL）和链霉素（50 μg/mL），在37 °C、含5% CO₂的湿润气氛中。细胞常规使用荧光Hoechst 33258染色（Merck KGaA，Darmstadt，德国）检测支原体污染。细胞实验中使用的所有化学品均购自Sigma-Aldrich（Darmstadt，德国）。本初步实验中使用的细胞传代数未记录（第5节）。对于振动实验，将细胞以两种初始密度接种于35 mm培养皿中：每皿10,000和20,000个细胞。由于MTT法为终点测量，为每个接种密度、条件（刺激和对照）和时间点准备单独培养皿。细胞在这些培养皿中培养并暴露于振动，MTT试剂直接加入培养皿（第3.3节）；未使用多孔板进行培养或刺激。在开始机械刺激前允许细胞过夜黏附。每日振动暴露期间，将刺激培养皿置于装置中心位置，相应对照培养皿置于装置旁台面上。刺激和对照培养皿在CO₂培养箱外室温下保持相同时间，约每天20 min，包括操作和15 min刺激。该程序确保刺激和对照培养物暴露于相同操作相关温度和气体气氛变化，因此组间差异主要可归因于机械刺激而非操作。培养后未处理对照细胞和接受机械振动细胞的代表性显微图像见图9。机械刺激使用自制振动装置施加。该系统利用连接至基于扬声器致动器的PWM发生器（XY-KPWM）产生低频机械振动。对于生物实验，振动频率设为30 Hz，装置输出设为30%。装置输出设置对应于PWM激励信号的占空比（30%；第2.5.1节），因此描述控制电子器件设置而非机械量。为此，刺激强度主要通过在該设置下测量的加速度表征。加速度使用固定于顶盖中心培养皿位置的MPU6050 MEMS加速度计模块（InvenSense/TDK，San Jose，California，USA）测量，记录加速度幅度范围为1.04至1.10 g。由于该传感器原始输出包括静态重力分量（1 g），测量范围被解释为合成加速度幅度，对应于约0.04–0.10 g的振动相关分量。假设30 Hz近似正弦运动，这对应于约10–30 μm量级的估计峰值位移；本研究中未直接测量培养容器位移。在第一系列实验中，每次刺激 session 持续每天15 min。对照样品相同处理但未接受机械振动。细胞每日暴露于振动一次，并在刺激开始后24、48和72 h评估代谢活性。在第二系列MTT实验中，检查刺激时长的影响。细胞每日一次暴露于相同设置（30 Hz，30%占空比）的振动150、300或450 s，并在72 h后评估代谢活性；以相同方式处理的未刺激培养物作为对照。细胞代谢活性使用MTT法（噻唑蓝四唑溴化物）评估，该方法基于代谢活跃细胞将四唑盐还原为不溶性甲臜。因此该实验用作细胞活力的间接指标；其本身并不测量细胞数量或增殖。制备储备溶液（5 mg/mL），使用前1:10稀释，并在避光条件下加入每个培养皿。培养皿孵育2 h以允许甲臜晶体形成。随后去除培养基，加入异丙醇溶解甲臜晶体。使用GloMax Multi Detection System（Promega，Madison，WI，USA）在560 nm测量吸光度。代谢活性表示为相应未刺激对照平均值的百分比，即第一系列中每个接种密度的24 h对照和刺激时长系列中72 h对照。细胞接种于35 mm培养皿中并孵育直至形成汇合单层。为抑制细胞增殖，达到汇合后将培养基中FBS浓度降至1%。使用无菌塑料微量移液器吸头在每个培养皿单层上创建无细胞区。划痕后，用基础培养基反复洗涤细胞以去除脱落细胞。然后将培养皿置于振动装置上，暴露于机械刺激（30 Hz，30%占空比）150或450 s，并孵育6和24 h；未刺激培养皿作为对照。无细胞区在显微图像中使用ImageJ软件（版本1.59g）分析，遵循Grada等所述方法。剩余无细胞区表示为0 h初始无细胞面积的百分比，间隙闭合计算为100%与剩余无细胞区之间的差值。第一系列MTT实验（两种接种密度）在两次独立实验中进行（每个孵育时间n = 2），刺激时长系列和划痕实验每组n = 3。数据表示为平均值±标准差（SD）。刺激与对照样品之间的差异使用Student t检验分析，p < 0.05被认为具有统计学意义。图中显著性水平表示为p < 0.05和* p < 0.01。本节介绍振动装置技术验证结果以及使用人牙龈成纤维细胞在受控振动刺激下进行的初步生物学评价结果。示波器测量确认所选低频激励信号的稳定产生。PWM控制系统在运行期间保持一致的30 Hz基频。FFT分析证明存在位于基频整数倍（60–180 Hz）处的高次谐波成分，这是矩形PWM激励的特征；然而，主导频谱成分仍位于所需刺激频率（图8）。重复示波器测量期间未观察到信号不稳定性。这些结果表征电激励信号；在生物实验中使用的刺激设置下，中心培养皿位置记录的合成加速度范围为1.04至1.10 g（第3.2节）。图10显示两种初始接种密度下每日30 Hz振动刺激后牙龈成纤维细胞的代谢活性，表示为相对于相应24 h未刺激对照（100%）的百分比。24 h后，振动处理培养物在两种接种密度下均显示高于相应对照的代谢活性；平均差异在每皿10,000细胞时为14.93个百分点，在每皿20,000细胞时为25.22个百分点。然而，Student t检验在两种情况下均未显示统计学显著差异（分别为p = 0.189和p = 0.098）。在48和72 h，刺激与对照培养物之间差异较不显著。在72 h，较低接种密度下刺激培养物中较高信号持续存在，而在其他情况下两组值相当。这些时间点也未发现统计学显著差异。24 h观察到的较高代谢活性可能表明细胞对低频机械刺激的早期响应，随后可能是细胞对实验条件的适应。尽管观察到的差异无统计学意义，其可能表明低频机械刺激对处理细胞的可能积极作用。由于MTT法反映细胞代谢活性，这些数据不应被解释为细胞数量或增殖变化的直接证据。实验期间显微镜下未观察到与振动暴露相关的活力降低或严重细胞毒性效应的可见迹象（图9）。为检查细胞响应是否依赖机械刺激时长，细胞每日一次刺激150、300或450 s，并在72 h后评估代谢活性（图11）。刺激细胞的代谢活性随振动刺激时长增加而逐渐升高。平均相对MTT信号在刺激150 s后达到114.92 ± 7.66%，300 s后达到134.44 ± 8.54%，450 s后达到154.01 ± 12.70%。与对照相比，刺激持续300 s（p = 0.0199）和450 s（p = 0.0179）时差异具有统计学意义，而150 s刺激后差异未达到统计学意义（p = 0.0777）。这些结果支持细胞生物学响应可能取决于所施加机械刺激时长的假设。图12显示低频机械刺激150 s和450 s后无细胞区闭合。6 h后，对照组平均间隙闭合为3.36 ± 1.10%。刺激150 s后达到4.02 ± 1.20%，而刺激450 s后达到35.41 ± 2.24%。对照与150 s刺激之间差异无统计学意义（p = 0.0848），而刺激450 s导致明显大于对照的间隙闭合（p = 0.0011）。24 h后，对照组间隙闭合达到21.16 ± 1.19%，刺激150 s后为28.43 ± 2.93%，刺激450 s后为53.40 ± 2.85%。与对照差异在150 s（p = 0.0241）和450 s刺激（p = 0.0014）时均具有统计学意义。本研究主要目标是设计、构建并在技术上验证一种用于体外细胞培养受控低频机械刺激的紧凑、成本有效振动装置。技术评价表明原型在所测试条件下满足预定义硬件要求。虽然集成PWM发生器技术上支持宽频率范围，但再利用致动器的物理限制将机械有效操作窗口限制在约20–90 Hz。在该范围内，数字示波术和FFT分析验证了感性负载下激励信号稳定30 Hz基频。以这种方式记录激励参数解决了自制实验室刺激平台的常见局限性，即这些参数并不总是得到验证或报告。然而应强调，该验证涉及供给致动器的电信号，其本身并不表征细胞经历的机械刺激。因此，培养位置的机械刺激通过固定于顶盖中心培养皿位置的MEMS加速度计测量的加速度单独表征（第3.2节）。与既往报道的振动平台相比，本装置旨在作为用于初步实验的低成本台面工具，而非高通量或培养箱集成系统（表1）。Biehl等的平台提供24个实验单元、基于激光多普勒振动术的膜位移表征（约28–92 μm）以及在CO₂培养箱内运行，而Grosman-Dziewiszek等的基于扬声器的测试台在培养箱内每天8 h向24孔板传递纳米级振动。两个系统均使用激光振动术进行机械表征，本装置尚未提供此功能。本平台的显著特征在于其由3D打印PLA部件和廉价商购电子模块构建、微型扬声器的PWM驱动、频率和占空比的直接调节，以及用于CO₂培养箱外标准35 mm培养皿短时暴露。估计振动分量约0.04–0.10 g位于近期体外研究中使用的低强度范围（低于1 g）内，其中对不同细胞类型施加了0.3–0.7 g的30 Hz信号。为补充技术验证，使用人牙龈成纤维细胞（GF06）进行初步生物学评价。该评估主要重点是初步指示细胞在CO₂培养箱外暴露于每日振动时刺激条件的生物学耐受性。MTT数据未显示振动处理培养物相比对照的代谢活性一致降低，显微镜下未观察到活力降低的可见迹象。这些观察表明，在所研究的特定条件下（30 Hz，30%占空比，每天150 s至15 min，长达72 h），刺激方案与明显细胞毒性效应无关。这与牙周膜细胞报道一致，其中活力降低或细胞稳态紊乱主要在较高刺激频率或幅度下观察到。由于MTT法反映代谢活性而非细胞数量或膜完整性，这些结果代表耐受性的初步指示而非生物学安全性的全面评估；为此，近期牙龈成纤维细胞研究已将代谢实验与活/死染色、增殖测量和形态分析相结合。代谢和功能实验结果为牙龈成纤维细胞对 developed 装置所传递机械刺激的响应提供互补信息。在第一系列中，振动处理培养物在24 h后在两种接种密度下均显示高于相应对照的代谢活性，但差异无统计学意义，且在48和72 h较不显著。在第二系列中，MTT信号随每日刺激时长增加而升高，刺激300和450 s后与对照差异具有统计学意义。一致地，划痕实验显示较长刺激与无细胞区更快闭合相关，刺激450 s后在6和24 h均明显更大的间隙闭合。由于划痕实验在降低FBS浓度的培养基中进行以抑制增殖，更快的间隙闭合最可能反映细胞迁移增加而非增殖。因此两种方法均表明生物学响应性质一致的方向，即代谢活性增加和无细胞区闭合加快，并提示响应特征和幅度可能取决于机械刺激时长。这与振动生物学响应强烈依赖频率、幅度、暴露时长和细胞类型的一般观察一致。由于时长依赖响应在恒定刺激设置下获得，其还提供表征刺激与生物学效应之间的功能联系。生物实验并非设计用于识别特定分子机制或证明治疗效果；其旨在作为装置在细胞模型上的功能验证。从这个角度看，机械刺激的应用反复与细胞行为可测量变化相关，这表明装置能够引发可测量生物学响应。然而，由于MTT法反映代谢活性而非细胞数量且独立重复数有限，这些发现应在更大、统计效能充分的研究中确认，然后才能得出关于特定生物学效应的结论。使用机械响应性强且常用于口腔生物材料和装置体外评价的牙龈成纤维细胞为此类研究提供相关参考模型。本研究应承认若干局限性。第一，示波器和FFT测量表征电激励信号而非细胞经历的机械振动。加速度使用低成本MEMS传感器而非校准参考加速度计记录，位移未直接测量，机械组件频率响应未表征。第二，尚未确定电信号中存在的高次谐波成分（60–180 Hz）是否机械传递至培养容器。第三，振动在培养皿表面和顶盖三个位置之间的空间均匀性未表征；为此，仅使用直接位于致动器上方的中心位置。第四，独立刺激 session 之间机械输出的可重复性未量化。第五，每日暴露在CO₂培养箱外室温下进行。在培养箱外约20 min期间，培养基向室温冷却，CO₂气氛丧失导致碳酸氢盐缓冲培养基逐渐碱化。尽管对照培养物相同处理，因此这些变化以相同程度影响两组，但这些短暂环境变化与机械刺激之间的相互作用不能完全排除为混杂因素。第六，生物学评价限于一种细胞类型、单一频率和强度设置、长达72 h观察期和两种实验；MTT法反映代谢活性且不直接测量细胞数量或增殖，划痕实验仅在两个时间点评价。此外，重复数（接种密度系列中两次独立实验，刺激时长系列和划痕实验中n = 3）有限，且细胞传代数未记录。这些局限性将在未来工作中解决。为从技术验证进展到统计效能充分的生物学研究，未来实验将实施激光振动术直接位移测量以补充加速度数据，连同顶盖不同位置和培养皿表面的加速度测量以及组件机械响应的频谱分析。此外，将需要更大样本量和额外独立实验以评估观察到的代谢变化的显著性，并将记录和报告所用细胞传代数。将使用补充实验，如活/死染色、直接细胞计数和增殖标志物（例如Ki-67或EdU掺入），以区分代谢活性、活力和增殖变化，并将实验扩展至受控生理条件，例如通过在温度控制台上于HEPES缓冲培养基中暴露或在CO₂培养箱内运行经改造、防潮版本的装置。本研究提出一种紧凑、低成本、3D打印振动平台，其使用PWM控制的微型扬声器向培养细胞传递低频机械刺激。示波器和FFT测量确认激励信号稳定30 Hz基频，生物实验中使用的刺激设置下合成加速度范围为1.04至1.10 g。在人牙龈成纤维细胞（GF06）实验中，CO₂培养箱外每日30 Hz暴露72 h与明显细胞毒性效应无关。刺激细胞的代谢活性随每日刺激时长增加而升高，刺激300和450 s后与对照差异具有统计学意义，且450 s刺激加速划痕实验中无细胞区闭合。这些结果表明装置能够引发依赖刺激时长的可测量生物学响应。在所研究的特定实验条件下，该装置因此适合初步体外机械生物学实验。在得出特定生物学效应结论之前，需要对刺激进行直接机械表征并开展具有独立重复的统计效能充分的生物学研究。