《Membranes》：Membrane Engineering for Ultrasound-Enhanced Cancer Nanomedicine: From Biological Membranes to Synthetic Acoustic-Responsive Systems
超声波可通过机械、热和声化学效应改变脂质膜的状态。本综述超越将膜视为被动载体的传统观点，将膜同时视为超声诱导刺激的靶标和肿瘤纳米医学中可调谐的功能界面。研究人员从膜工程的角度比较了天然细胞膜、人工脂质膜和杂合膜的声学响应特性，讨论了膜变形、相变和氧化如何促进缺氧缓解、局部药物释放、联合治疗和免疫调节，而直接将膜变化与治疗结果相关联的证据仍然有限。研究人员提出，临床转化的关键在于建立膜组成、原位声暴露、膜响应和治疗输出之间可量化且可重现的对应关系。将膜重新定义为可调谐的声学响应界面，可为超声增强的肿瘤纳米治疗提供更具可控性的设计框架。
论文主体内容总结
1. 引言
超声在肿瘤医学中的定位正在演变，其不再仅仅是成像工具，而是日益被视为可在时间和空间上加以控制的治疗能量来源。声动力疗法（SDT）、聚焦超声（FUS）及不同频率的超声照射已被用于增强深部组织的肿瘤细胞杀伤、诱导肿瘤消融和调节肿瘤微环境。纳米材料的引入改变了声能转化的途径，使原本分散的机械、热和声化学效应汇聚为药物释放和活性氧（ROS）生成等治疗输出。然而，现有设计仍以声敏剂和纳米载体为核心。在脂质体、仿生细胞膜和杂合膜平台中，膜层主要被用于提供生物相容性、免疫逃逸或靶向识别功能。膜并非惰性外壳，而是能够感知并传递机械、热和氧化刺激的动态软界面。因此，应将膜同时视为超声诱导刺激的靶标和可调谐的功能界面，将膜组成与声暴露条件结合起来理解膜响应及其对治疗结果的贡献。
脂质膜可被视为高度动态的软物质界面，其结构稳定性主要由脂质分子间的非共价相互作用主导，并受膜流动性、曲率和相态调节。超声传播过程中，机械应力、空化相关剪切力、局部热效应及声化学产生的ROS可干扰这些物理化学参数，导致膜结构失稳。不同膜系统对超声的响应不一致，这在设计中尤为关键。天然细胞膜可保留部分脂质组成和膜蛋白，赋予纳米平台免疫逃逸、同源识别或肿瘤归巢等功能，但其复杂组成及供体变异性、分离过程和批次异质性使其声响应行为难以精确预测和系统调控。合成脂质膜的优势在于脂质类型和比例明确，可通过胆固醇含量、脂质饱和度及相变温度等参数调控膜对机械扰动、热刺激和氧化应激的敏感性。基于此，由天然细胞膜和合成脂质组装的杂合膜有望同时整合生物识别能力和可调谐的声响应性，同时缓解天然膜的异质性和纯合成膜的功能局限。
2. 超声诱导膜响应的机制
2.1 超声对脂质膜的机械效应
超声可在不引起显著膜破裂的情况下改变脂质膜的机械状态。声压振荡、声辐射力和声流产生的剪切均可作用于脂质双分子层，导致膜张力、面积和脂质排列发生变化。低强度超声辐射力可驱动脂质膜振荡和位移，仅引起不到1%的膜面积和电容变化，表明膜可通过可逆变形而非立即的结构失效来响应声学机械作用。分子动力学研究进一步表明，聚焦超声诱导的机械扰动可改变双分子层中脂质链的面积、厚度和有序度，不同脂质组成的膜表现出显著不同的结构响应。
当超声诱导的膜变形进一步破坏脂质堆积时，局部堆积缺陷可暂时增加膜通透性，这种变化不一定伴随稳定孔道形成或整体膜破裂。在20 kHz超声条件下，脂质体中的钙黄绿素主要在超声照射期间释放，照射停止后释放迅速减弱，该结果更符合缺陷介导的透化而非膜撕裂或稳定孔道形成。当存在空化核时，微泡可进一步将声学机械作用集中于膜的局部区域。传统观点认为稳定空化主要通过周期性振荡、声流和剪切增强膜通透性，而惯性空化与更严重的局部损伤相关。然而，近期直接成像研究表明这一区分并非绝对。在较温和的超声驱动条件下，细胞附近的微泡可产生重复的稳定微射流，引起局部膜穿孔和分子内流。当气泡经历更强烈的非线性收缩或惯性塌缩时，微射流、冲击波和局部高剪切可进一步放大膜损伤。这种损伤不一定意味着不可逆破坏，实时成像观察到单脉冲超声作用于粘附微泡可形成微米级膜孔，约60%受损细胞能在5秒内重新密封。
2.2 热效应与脂质膜的相变
超声在生物组织中传播时，部分声能可通过黏性耗散和分子弛豫转化为热能，导致局部温度升高。当温度接近膜的相变范围时，这种升温对脂质膜的影响尤为显著。随着温度升高，脂质双分子层逐渐从有序的凝胶相转变为更流动的液晶相。在两相共存的温度范围内，脂质缺陷的局部积累和相界面的增加削弱了膜的屏障功能，促进包封物质的释放。当温度低于相变范围时，热诱导的通透性变化通常较弱。
2.3 超声诱导ROS介导的膜氧化、透化与破坏
除机械和热效应外，超声诱导的空化可产生高活性氧物种（ROS），通过膜脂质氧化改变脂质双分子层的结构和屏障功能。分子模拟表明，超声-微泡系统中产生的羟基自由基（•OH）可穿透磷脂头基以下的膜界面区域，接近多不饱和脂肪酸链中的烯丙基C–H位点，为自由基夺氢和后续脂质过氧化提供空间条件。脂质自由基（L•）形成后可与分子氧反应生成脂质过氧自由基（LOO•），后者进一步从相邻不饱和脂质中夺取氢原子，形成脂质氢过氧化物（LOOH）和新的L•，从而沿膜内易氧化脂质传播氧化反应。
脂质过氧化对膜结构的影响并非单向，而是与形成的氧化产物的化学结构密切相关。当OX2占主导时，随着其比例增加，平均脂质面积减少约7%，膜厚度增加约7%，脂质链有序度增加，表现为膜轻微硬化。相反，当OX2维持在25%而尾链氧化形成的醛类产物（ALD）逐渐增加时，膜结构呈现相反趋势：脂质排列日益松散，平均脂质面积增加，膜厚度和脂质链有序度均降低。在较高ALD比例下，平均脂质面积增幅可达约28%。氧化并不必然导致膜的单向"软化"或"硬化"，关键在于氧化反应最终形成的脂质结构类型。脂肪酸链的截断和极性基团的引入可显著破坏疏水区原有的紧密排列，使双分子层从相对有序状态转变为更松散、更流动的结构。
次级氧化脂质对膜的影响不仅取决于其总体含量，还取决于局部富集程度。当PoxnoPC均匀分散时，膜在模拟时间尺度上保持整体完整，但Na+和Cl?的跨膜自由能垒持续降低。当PoxnoPC含量达到50 mol%时，Na+通透性从约10?11 m/s增至3 × 10?6 m/s，Cl?通透性从约2 × 10?15 m/s增至6 × 10?11 m/s，分别增加约5个和4个数量级。当PoxnoPC形成局部高浓度区域时，模拟观察到纳米级膜孔的自发形成，随着氧化脂质逐渐扩散，膜孔可收缩甚至关闭。
3. 不同膜系统的超声响应
3.1 天然细胞来源的膜
完整活细胞中的轻度膜损伤可能通过膜重排和细胞自身修复过程恢复，而更强或更持久的效应可能导致无法有效密封的膜孔，引起细胞质成分泄漏甚至不可逆膜损伤。不同天然膜对相同超声暴露的反应可能存在显著差异。膜系统的结构层次可影响超声机械扰动的初始位置和损伤向更深结构层扩展的方式。对于真核细胞，质膜是超声与细胞相互作用的主要界面。低频超声可诱导牛红细胞释放血红蛋白，微泡介导的超声可促进不同免疫细胞摄取细胞外示踪剂，HeLa细胞在声穿孔后碘化丙啶（PI）摄取增加。相比之下，革兰氏阴性菌具有由外膜、肽聚糖层和内膜组成的多层包膜，超声引起的屏障破坏具有更明显的层次性。
细胞整体机械状态及其与细胞骨架的耦合也影响超声诱导的透化。G1期HeLa细胞弹性模量最高，S期细胞最低。微泡介导的超声后，S期细胞表现出最快的PI摄取和α-微管蛋白解聚，而G1期细胞的变化相对较弱。在大多数当前仿生超声纳米平台中，天然膜的主要作用是提供与来源细胞相关的生物界面功能，如减少免疫清除、增强病灶粘附或赋予特定细胞识别能力。可控制的超声响应通常由系统中引入的额外功能组件承担。天然细胞膜由多种脂质、胆固醇和膜蛋白组成，其膜流动性、脂质有序度和机械性能相互关联并受来源细胞类型和生理状态共同影响，这些参数难以单独连续调节。
3.2 合成脂质膜
3.2.1 机械响应型脂质膜
在脂肪酸链结构相同的情况下，磷脂头基的化学性质可显著改变脂质膜对超声机械扰动的响应。含有相同棕榈酰-油酰脂肪酸链但头基不同的POPC、POPE、POPG和POPS双分子层，在超声作用下平均脂质面积（APL）的变化排序为POPC > POPS ≥ POPG > POPE。POPC较大的胆碱头基和其水合特性为膜提供更大的侧向面积自由度。POPE较小的乙醇胺头基允许脂质间更强的氢键作用，界面排列更紧密。值得注意的是，APL变化较大并不一定意味着膜更容易发生不可逆失稳。POPC和POPE在约30–35 bar和低于15–20 MHz时开始出现显著结构异常，而POPG和POPS通常需要约40–45 bar和低于10 MHz的更强机械载荷才表现失稳，且一旦超过该范围结构变化更为突然。
磷脂组成也影响载药脂质体在超声下的机械释放行为。DSPE含量与声敏感性呈显著正相关。在40 kHz连续超声下，DSPE富集脂质体的药物释放显著高于DSPC主导的参考脂质体。当胆固醇与DSPE-PEG2000比例固定时，DSPE含量从47 mol%增至62 mol%，超声暴露6分钟后DOX释放增加约51个百分点。实验过程中样品温度维持在30 °C以下，远低于这些饱和长链磷脂的主相变温度，因此该释放行为不太可能由整体膜热相变主导，更可能与PE头基对局部脂质堆积的影响有关。
DOPE对超声机械响应有更直接的结构证据。DOPE含有较小的乙醇胺头基和两条不饱和酰基链，分子几何更接近锥形，具有更强的负自发曲率和形成非层状相的倾向。在含DOPE的脂质体系中，超声可显著增强钙黄绿素释放并诱导显著的膜拓扑重排。小角X射线散射（SAXS）结果表明，适当PE含量的膜在超声处理前主要保持层状排列，处理后转变为负曲率倒六方相。DOPE的作用不仅是增加膜的"柔软度"，更重要的是降低了脂质双分子层重排为高曲率非层状结构的能量代价。
DOPE富集的多组分膜与HSPC主导的有序膜在超声处理下表现出显著不同的药物释放行为。IMP301在24 kHz连续超声下DOX释放率达58.8%，而Doxil仅为10.2%。分子动力学模拟显示，IMP301中脂质的侧向扩散系数约为1.36–1.48 × 10?7 cm2/s，显著高于Doxil的0.11 ± 0.01 × 10?7 cm2/s。IMP301表现出更明显的膜曲率，而HSPC主导的Doxil双分子层更厚且脂质排列更有序。MSPC作为单酰基链溶血脂质，与锥形DOPE具有一定分子几何互补性，可缓解DOPE富集膜中的局部堆积挫折。胆固醇的作用更为复杂，增加胆固醇可通过脂质-胆固醇相互作用限制侧向迁移，但同时增加DOPE富集膜的曲率，这两种作用对膜稳定性的影响相反。
3.2.2 热响应型脂质膜
在热响应脂质体系中，膜组成决定热响应窗口，超声提供进入该窗口的局部加热。当超声产生的局部升温接近并进入膜的相变区域时，凝胶相和液晶相共存，其界面处脂质堆积缺陷增加，膜屏障减弱，促进包封药物释放。通过调整DPPC与高相变温度HSPC的比例，可覆盖约40–51 °C的相变温度范围。不含HSPC的配方F0对温度最敏感，在37 °C含血浆体系中早期孵育即释放约35%的DOX，加热至42 °C时接近完全释放。添加25 mol% HSPC的F25在42 °C时释放相对较慢，但显著减少了生理温度下的过早泄漏。当超声热疗维持肿瘤局部约40–42 °C时，F25实现更高的肿瘤DOX积累和更好的治疗效果。
将胆固醇和弹性蛋白样多肽（ELP）引入DPPC膜可进一步扩展生理温度稳定性与热触发释放之间的窗口。与传统DPPC/MSPC型低温敏感脂质体相比，该稳定温敏脂质体（STL）在37 °C血清环境中具有更好的药物保留能力，同时在39–42 °C范围内可快速释放DOX，在42 °C下10秒内释放超过95%的包封药物。STL-DOX的循环半衰期约为2.03小时，而传统LTSL约为0.92小时。
聚焦超声实验表明，评估热敏脂质膜时不能简单将外部声压等同于材料本身的触发阈值。在1 MHz FUS下，1.75 MPa时样品温度升至约42 °C，10分钟内释放约85%的DOX，与42 °C水浴加热的释放动力学相似。热敏脂质膜设计的核心不是寻找理想的单一相变温度（Tm），而是确保膜的基本稳定性、热响应范围和释放动力学与靶区实际形成的温度-时间轨迹相匹配。
3.2.3 ROS响应型脂质膜
人工脂质膜对超声相关ROS的敏感性主要取决于膜是否为氧化反应提供合适的化学环境。脂肪酸链的不饱和度和可氧化位点数量可影响自由基夺氢及后续链反应的发生。胆固醇和亲脂性抗氧化剂等膜调节组分可改变自由基在膜内的传播和终止过程。ROS生成位置也至关重要，当声敏剂嵌入脂质双分子层且靠近易氧化脂质时，短寿命ROS更可能启动膜内脂质过氧化。
普通不饱和磷脂膜可响应超声产生的氧化刺激，而膜内保护组分可显著改变这一过程。卵磷脂脂质体经超声处理后，共轭二烯、脂质氢过氧化物和丙二醛均随超声剂量增加而增加。胆固醇的加入使丙二醛产量减少约93%，BHT和α-生育酚分别减少约88%和85%。BHT和α-生育酚主要通过抑制自由基链反应发挥作用，而胆固醇更可能通过改变膜内脂质排列和氧化底物的可及性影响过氧化过程。
同时引入声敏剂和易氧化脂质可主动增强超声诱导ROS向膜结构变化的转化。由DLPC、DSPC、DSPG和胆固醇组成的脂质体，以PPIX为声敏剂，DLPC提供易过氧化的不饱和脂肪酸链。PPIX负载量变化时，ROS生成和超声诱导染料释放均显著变化，在PPIX质量负载比约0.3%时达到峰值。将可过氧化的DLPC替换为饱和DSPC后，即使维持声敏化条件，超声诱导染料释放也显著降低。将声敏剂直接锚定在脂质双分子层上可加强ROS生成位点与可氧化膜脂质之间的空间耦合。含2 mol%焦脱镁叶绿酸-脂质（Pyro-lipid）的脂质体在低强度聚焦超声下表现出显著增强的DOX释放，自由基清除剂可显著抑制释放过程，质谱分析检测到与DOPC氧化一致的脂质产物。
3.3 杂合膜：整合生物功能与工程化声响应性
由天然膜和合成脂质组成的杂合膜的关键优势在于保留天然膜生物学特征的同时引入难以独立调节的膜性质。将低相变温度DOPC掺入天然细胞膜可显著增加杂合膜流动性，改善膜片段的融合和纳米颗粒的完全包封。使用更流动的多不饱和磷脂时，完全包封比例继续上升。
将红细胞膜与含HMME和不饱和人工脂质的脂质体融合构建的DOX/HMME@FA-NL杂合纳米囊泡提供了直接例证。超声应用后，HMME首先促进ROS生成，随后氧化杂合膜中的不饱和磷脂，导致膜结构损伤并促进DOX释放。与饱和脂质对照膜相比，不饱和脂质杂合膜在超声下表现出显著更高的药物释放。然而，现有研究主要比较有限数量的膜组成，尚未建立人工脂质比例、不饱和度与触发释放之间连续可预测的定量关系。
4. 超声响应膜纳米平台在肿瘤中的治疗应用
4.1 改善缺氧和应激抵抗肿瘤的治疗效果
超声诱导的膜响应可通过多种机制缓解肿瘤缺氧并放大氧化损伤。第一，膜失稳可促进自噬抑制剂释放，削弱肿瘤细胞的缺氧应激适应。CCM-HMTNPs/HCQ系统中，癌细胞膜包被可减少巨噬细胞清除并通过同源识别促进肿瘤组织积累。超声处理后，透射电子显微镜（TEM）显示原本连续的癌细胞膜包被出现显著破坏和膜碎片化，HCQ释放增加54.2%。释放的HCQ阻断声动力疗法（SDT）诱导的保护性自噬，同时改善异常血管表型并减少肿瘤缺氧。第二，超声诱导脂质壳破坏可促进局部氧气释放。Ce6-O2纳米气泡将Ce6掺入脂质壳并稳定携氧气体核心，到达肿瘤后超声靶向破坏纳米气泡使携氧脂质壳结构失稳，促进局部O2释放，缓解肿瘤缺氧并增强ROS生成。第三，ROS介导的膜脂质氧化可进一步增加膜通透性或诱导膜失稳。DOX/HMME@FA-NL中，超声激活HMME产生的ROS氧化杂合膜中的不饱和磷脂，导致膜结构不稳定并促进DOX释放，将ROS从终末细胞毒性因子转化为次级治疗触发信号。
4.2 增强时空药物递送与联合治疗
载药纳米平台始终面临循环稳定性与肿瘤局部快速释放之间的矛盾。超声响应膜工程提供了一种调和途径：膜层在非触发条件下维持药物包封，而局部超声应用在指定治疗区域和时间窗口内将其转变为高通透或不稳定状态。TARDOX I期临床试验纳入了10例不可切除或不可消融的原发或转移性肝脏肿瘤患者，静脉输注重溶血脂质热敏脂质体（LTLD）后，聚焦超声将治疗区域维持在约39.5–43 °C，使局部温度进入LTLD的热响应范围。聚焦超声治疗后，肿瘤内DOX平均浓度从2.34 ± 0.93 μg/g增至8.56 ± 5.69 μg/g，平均增加3.7倍。临床前研究中，42 °C模拟脉冲HIFU热剂量条件下，低温敏感脂质体（LTSL）在2分钟内释放约50%的DOX，而非热敏脂质体（NTSL）无可检测释放。LTSL联合脉冲HIFU后肿瘤内DOX浓度约为其他DOX治疗组平均水平的3–4倍，肿瘤生长至500 mm3的平均时间为11.8天，而其他治疗组约为5.7–7.8天。
4.3 膜介导的免疫抑制肿瘤微环境调节
载体膜的可控开启可将局部超声刺激转化为免疫相关载荷的按需释放。空化响应脂质体IMP301递送DOX时，短脉冲HIFU处理后冷冻电镜（Cryo-TEM）分析显示脂质体腔内DOX显著减少，膜表面形成孔状结构。IMP301联合HIFU治疗增强了CRT暴露和HMGB1释放，同时增加肿瘤内CD8+ T细胞、NK细胞和M1巨噬细胞。与抗PD-1联合时，IMP301加HIFU还表现出远处肿瘤抑制效应。含卟啉脂质和可氧化DOPC的囊泡系统中，超声产生的ROS氧化脂质膜使囊泡失稳，随后释放STING激动剂SR-717，促进I型干扰素产生、树突状细胞成熟和CD8+ T细胞浸润。将全氟戊烷（PFP）掺入脂质体的系统中，低强度聚焦超声诱导PFP液-气相变和空化，导致脂质膜瞬时穿孔和结构扰动，促进cGAMP释放。
DMC@P-Cs系统由含不饱和双键的DOPC可氧化脂质层组成，通过外层硅氧烷网络增强循环稳定性。局部超声激活膜内声敏组分产生ROS，氧化DOPC并增加膜通透性，促进去甲斑蝥素（DMC）释放。声动力过程诱导免疫原性细胞死亡并促进CRT暴露，释放的DMC抑制Treg形成，缓解局部免疫抑制并增强CTL/Treg比值。在CT26结直肠癌模型中，P-Cs联合超声的肿瘤抑制率约为73.95%，而DMC@P-Cs联合超声进一步将抑制率提高至约94.8%。
5. 临床转化的挑战与展望
超声响应膜纳米平台的临床转化面临特异性挑战：治疗输出并非仅由制剂本身决定，而是由膜材料、局部声暴露和体内环境之间的相互作用共同决定。缺乏能实时验证膜在体内是否真正进入预期响应状态的监测方法。
膜材料及其制备工艺的一致性是一个关键问题，在天然细胞膜包被系统中尤为突出。天然细胞膜含有多种磷脂、胆固醇、糖链和膜蛋白，其组成和组织状态易受来源细胞类型、培养传代条件、膜提取方法和储存过程影响。质量控制不应局限于粒径、表面电位或膜包被是否完整等常规指标，还应结合脂质组成、膜流动性和完整性、蛋白保留及包封效率的测量。储存研究应追踪聚集、脂质降解和载荷泄漏。应在标准化声学条件下评估有无超声时的释放曲线，并在独立制备的批次间评估激活阈值。
第二个关键挑战是如何将设备输出参数转化为可比较且可重现的靶区声暴露。现有研究常用设备标称功率、功率密度和暴露时间描述超声条件，但这些指标不能充分反映膜所在位置实际经历的声场。应全面描述声压或强度、空间分布、脉冲条件、测量方法及其不确定性，并估算临床或复杂组织条件下靶区的原位暴露。膜触发阈值不能脱离具体声学条件定义，存在临界压力阈值且不同频率下阈值不同。释放程度不仅取决于峰值声压是否超过阈值，还取决于脉冲周期内声压维持在阈值以上的持续时间。
第三个挑战是缺乏能直接报告体内膜功能状态和实际载荷释放的实时监测方法。声发射可表征局部空化活动，但只有经过特定膜配方校准后才能作为膜响应和释放状态的替代指标。热响应系统面临类似挑战，温度监测方法可确认靶区是否接受足够的热暴露，但不能直接指示脂质膜的相变程度、瞬时通透性或治疗过程中跨膜释放的DOX量。
另一个常被低估的转化挑战是膜进入血液后能否维持体外观察到的触发特性。血浆蛋白快速吸附到膜表面，重塑其界面环境，可能影响基线泄漏、触发阈值和药物释放动力学。LTSL在不同环境中均保持快速热触发释放，而TTSL的行为受血浆蛋白显著影响。超声响应膜的临床前评估不应仅限于PBS或培养基中的触发释放实验，更有意义的是在血浆或全血孵育后重新评估基线泄漏、响应阈值、释放速率和膜完整性。
6. 结论
超声响应膜纳米平台的发展正在改变膜在肿瘤纳米医学中的传统角色。膜不再仅仅是负责包封、稳定、免疫逃逸或靶向识别的被动界面，而是作为可调谐的声学响应功能界面。实现临床转化的关键在于建立膜组成、原位声暴露、膜响应和治疗输出之间可量化且可重现的对应关系，确保膜响应从实验条件下的可控过程转化为可重复的临床策略。
