SARS-CoV/SARS-CoV-2刺突蛋白融合肽在溶血磷脂胶束中的膜结合、构象与动力学研究

《Membranes》：Membrane Association, Conformation, and Dynamics of SARS-CoV/SARS-CoV-2 Spike Fusion Peptides in Lysolipid Micelles

　　

冠状病毒（CoV）刺突糖蛋白内的融合肽与宿主细胞膜相互作用，并参与膜融合所需的结构重排。本研究利用稳态和时间分辨荧光光谱、圆二色光谱（CD）、电子自旋共振（ESR）以及分子动力学（MD）模拟，系统研究了严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）的上游融合肽（FPu）以及SARS-CoV/SARS-CoV-2的保守内部融合肽（IFP）在两性离子和阴离子型溶血磷脂胶束中的行为。两种肽均与胶束相强烈结合，其中IFP显示出更高的分配系数，并对带负电荷的胶束表现出更明显的偏好。FPu展现出显著的环境敏感荧光变化，而CD则揭示IFP具有更强的α-螺旋倾向，FPu则表现出更高的构象异质性。ESR显示，两种肽均限制了自旋探针的旋转动力学，且在阴离子胶束中，特别是在酸性pH条件下，其效应更为广泛和强烈。MD模拟进一步揭示了动态的胶束结合拓扑结构，其中肽的中心区域优先与脂质结合且溶剂暴露较少，而末端区域则保持更大的灵活性。综合结果表明，肽的亲和力、构象、结合态拓扑结构以及对胶束动力学的扰动是相互关联但不等价的特性，凸显了膜组成和环境条件在调节冠状病毒融合肽相互作用中的重要性。

研究背景与科学问题

冠状病毒（CoV）是一种包膜病毒，其入侵宿主细胞的关键步骤是通过膜融合实现。这一过程由病毒表面的刺突（Spike, S）糖蛋白介导。S蛋白包含S1和S2两个功能亚基，其中S2亚基负责驱动膜融合。在S2亚基内，存在多个被称为融合肽（Fusion Peptides, FPs）的膜活性区域，这些短肽片段通过与宿主细胞膜相互作用，改变膜的物理化学性质（如脂质有序性、水合作用和曲率），从而促进膜融合所需的膜重塑。对于SARS-CoV和SARS-CoV-2，研究者们关注两个关键的融合肽区域：位于S2'切割位点上游的上游融合肽（FP_u）和靠近HR1区域的内部融合肽（IFP）。尽管已有研究表明这两种肽都能与模型膜结合并影响膜结构，但它们在高度弯曲的脂质组装体（如胶束）中对膜电荷和pH值的响应，以及膜亲和力与肽构象、定位和脂质动力学扰动之间的关系，尚不完全清楚。为此，研究人员利用溶血磷脂胶束作为膜模拟体系，旨在系统比较FP_u和IFP在不同条件下的相互作用模式。

主要技术方法

1. 1.
   稳态和时间分辨荧光光谱：用于测定肽与胶束的分配系数（K_p），并监测色氨酸（Trp）或酪氨酸（Tyr）残基所处的微环境极性变化。
2. 2.
   圆二色光谱（CD）：用于分析肽在膜模拟环境中二级结构的倾向性，特别是α-螺旋含量。
3. 3.
   电子自旋共振（ESR）：利用不同位置的脂肪酸自旋探针（5-SASL, 12-SASL, 16-SASL, 16-MESL），检测肽的结合对胶束内烃链局部动力学和堆积状态的影响。
4. 4.
   分子动力学（MD）模拟：从实验确定的核磁共振（NMR）结构出发，模拟肽在十二烷基磷酸胆碱（DPC）和1-十四酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)（LMPG）胶束中的结合拓扑结构、径向定位和构象动态。

主要研究结果

3.1 肽-胶束荧光结合实验

通过荧光滴定实验，研究人员发现IFP在所有实验条件下均表现出比FP_u更高的胶束分配系数，表明其具有更强的胶束亲和力。两种肽都优先与带负电的溶血磷脂酰甘油（LPG）胶束结合。FP_u在结合后其发射光谱发生显著的蓝移，尤其在LPG中，表明其色氨酸残基进入了更疏水的环境。时间分辨荧光测量显示，两种肽在胶束中的平均荧光寿命均增加，但在两性离子溶血磷脂酰胆碱（LPC）胶束中的寿命长于LPG胶束，这与分配系数的趋势并不完全一致，说明荧光寿命反映的是局部微环境而非整体亲和力。

3.2 圆二色光谱与二级结构分析

CD光谱分析表明，FP_u在胶束环境中呈现构象异质性，包含α-螺旋和β-折叠等多种结构，其α-螺旋含量约为18-27%。相比之下，IFP表现出更明确的α-螺旋特征，其螺旋含量高达36-46%，表明其在膜模拟环境中具有更强的形成稳定螺旋结构的倾向。IFP的β-结构贡献极小，进一步证实了其以α-螺旋为主的构象特点。

3.3 自旋标记脂质的ESR分析

ESR实验结果显示，FP_u和IFP的加入普遍降低了自旋探针的旋转运动性，表明它们限制了胶束烃链的局部动力学。这种限制作用在阴离子LPG胶束中更为显著和广泛，尤其是在酸性pH（5.0）条件下。值得注意的是，虽然IFP的分配系数更高，但FP_u在某些位置上引起的探针运动受限程度与之相当甚至更大，这表明肽的膜亲和力与其对膜动力学的扰动能力是两个不同的属性。

3.4 肽-胶束相互作用的MD模拟

MD模拟提供了肽在胶束内结合状态的原子级细节。结果显示，两种肽均能稳定地与DPC和LMPG胶束结合，但其径向定位受胶束类型影响。经胶束半径归一化后，两种肽在DPC中的定位相对更靠近胶束中心，而在LMPG中则更倾向于外围。两种肽的中心疏水区域优先与胶束脂质相互作用，溶剂暴露较少，而末端区域则更加灵活且更多地暴露于水相。二级结构分析表明，FP_u保持了较高的α-螺旋结构，但存在瞬时局部解离，而IFP则维持了一个稳定的中心α-螺旋区域（约残基6-15），其N端则更具构象动态性。

讨论与结论

讨论部分指出，FP_u和IFP通过疏水和静电相互作用与高曲率脂质组装体结合，但展现出截然不同的膜结合行为。IFP具有更强的膜分配能力和更高的α-螺旋倾向，而FP_u则表现出更大的构象异质性，但仍能插入胶束的疏水核心并有效扰动表面活性剂的动力学。研究强调，肽的亲和力、局部荧光环境、结合态拓扑结构和对胶束动力学的扰动是相互关联但不等价的特性。负电荷表面增强了肽的缔合，尤其是对胶束动力学的扰动，而酸性pH值则主要影响肽结合后的结构后果而非结合本身。

研究结论翻译：FP_u和IFP展现出与膜模拟胶束相互作用的独特但互补的模式。IFP表现出更强的胶束分配和更高的α-螺旋结构保持倾向，而FP_u则显示出更大的构象异质性，同时仍能诱导对胶束动力学的显著扰动。综合荧光、CD、ESR和MD结果进一步表明，肽的亲和力、局部荧光团环境、结合态拓扑结构以及对表面活性剂动力学的扰动是相互关联但不等价的特性。特别是，与带负电胶束的优先相互作用以及ESR检测到的pH依赖性变化，突出了膜组成和环境条件在调节融合肽行为中的重要性。总体而言，这些发现提供了一个更整合的分子图像，展示了不同的刺突融合肽区域如何与与冠状病毒膜融合相关的高度弯曲的脂质组装体结合并对其进行重组。