运动通过肝脏-心脏交互作用诱导的Clusterin促进心肌梗死后心脏再生

《Cell Reports》：Clusterin, through exercise-mediated liver-heart crosstalk, promotes heart regeneration after myocardial infarction

　　

心肌细胞丢失驱动心脏重塑并最终导致心力衰竭，凸显了促进心脏再生的必要性。已知运动可增强心脏修复并刺激心肌细胞增殖，但其潜在机制仍不清楚。在本研究中，研究人员证明运动诱导的外泌因子Clusterin介导了跑步血浆对心肌梗死（MI）后心脏修复和心肌细胞增殖的促再生效应。心脏特异性Clu基因敲除减弱了MI后心脏再生，而Clusterin过表达则增强了这一过程。重组Clusterin给药促进了成年小鼠MI后的心脏再生。机制上，Clusterin通过与IκBα直接结合，经蛋白酶体依赖性IκBα降解激活NF-κB。此外，肝脏被确定为运动诱导的循环Clusterin的主要来源；肝细胞特异性Clu敲低消除了运动血浆对心脏再生的刺激作用。本研究揭示了一种肝脏-心脏交互作用机制，即运动诱导的Clusterin促进心肌细胞增殖，将Clusterin定位为MI后心力衰竭的潜在治疗靶点。

研究背景与科学问题

心肌梗死（MI）是全球人类死亡的主要原因之一。斑马鱼和新生哺乳动物能够通过现有心肌细胞的增殖实现MI后心脏再生，而成年哺乳动物心脏因心肌细胞增殖能力极其有限而几乎无法再生。因此，刺激心肌细胞增殖的策略为治疗MI提供了有前景的途径。运动已被证实能够促进MI后心脏再生，例如跑步可使成年小鼠MI后心肌细胞增殖增加高达4.6倍。尽管已有研究表明胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、神经调节蛋白-1、miR-222以及PI3K/AKT和EGFR/JNK信号通路的激活参与其中，但其潜在机制仍不明确，这构成了临床转化的重大障碍。运动触发多种生物活性分子（统称为“外泌因子”）的释放，包括来自骨骼肌的肌因子、来自肝脏的肝因子和来自脂肪组织的脂肪因子。这些外泌因子被认为介导了运动的系统性健康益处。然而，运动如何通过特定外泌因子促进MI后心脏再生的具体分子机制尚待阐明。

研究内容与主要发现

本研究发现，运动后血浆可显著促进心肌细胞增殖。进一步蛋白质组学筛选揭示，Clusterin（又称载脂蛋白J，ApoJ）——一种广泛表达于多种体液和组织中的多功能糖蛋白——在一系列运动诱导的外泌因子中发挥最重要的促增殖作用。研究证实，运动促进肝脏释放Clusterin进入血浆，进而增强MI后心肌细胞增殖和心脏再生。通过心脏特异性Clusterin条件性敲除小鼠和AAV9介导的Clusterin过表达实验，研究人员证明了Clusterin对心脏再生的必要性。重组Clusterin给药同样能够改善心功能、减少瘢痕面积并促进心肌细胞增殖。机制上，Clusterin通过受体/网格蛋白介导的内吞作用进入心肌细胞，主要依赖LRP2受体。进入细胞后，Clusterin与IκBα直接结合，促进其与E3泛素连接酶β-TrCP的结合，通过泛素-蛋白酶体途径加速IκBα降解，从而激活NF-κB信号通路，上调细胞周期调节因子（如Cyclin D1、Cyclin A2、Cyclin E1、Cyclin B1、CDK2和CDK4），最终驱动心肌细胞增殖。重要的是，研究人员确定肝脏是运动诱导的循环Clusterin增加的主要来源。利用AAV8-TBG-Cre实现肝细胞特异性Clu敲除，可显著降低运动诱导的血浆Clusterin升高。通过AAV8-shCLU特异性敲低肝脏Clusterin，收集的运动血浆丧失了促进MI后心脏功能恢复、减少瘢痕面积和刺激心肌细胞增殖的能力，从而建立了肝脏来源的Clusterin在运动血浆介导的心脏再生中的因果作用。

关键技术方法

1. 1.
   小鼠运动模型与血浆移植：采用8周龄C57BL/6J小鼠进行为期28天的跑步运动训练（12米/分钟，每天60分钟），收集运动血浆（RP）和静坐对照血浆（CP），通过尾静脉注射（每两天200 μL）至MI模型小鼠体内评估心脏再生效果。
2. 2.
   定量蛋白质组学：利用液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）鉴定RP与CP之间的差异表达蛋白，结合UniProt数据库功能注释筛选促增殖候选蛋白。
3. 3.
   转基因小鼠模型：构建心脏特异性Clusterin条件性敲除小鼠（Clu-CKO，通过Clusterin^fl/fl与Myh6^MerCreMer杂交并经4-OH-他莫昔芬诱导）和MADM^GT/TG遗传谱系示踪小鼠（用于无偏倚检测完成胞质分裂的心肌细胞）。
4. 4.
   病毒介导的基因操作：使用AAV9载体实现心肌内Clusterin过表达（AAV9-CLU-OE-eGFP），使用AAV8载体实现肝脏特异性Clusterin敲低（AAV8-shCLU-eGFP）和肝细胞特异性敲除（AAV8-TBG-Cre）。
5. 5.
   细胞与分子机制研究：分离新生大鼠心室肌细胞（NRVMs），结合特异性内吞抑制剂（氯丙嗪、制霉菌素、阿米洛利）和siRNA敲低（LRP2、ApoER2、TLR4）鉴定Clusterin摄取途径；通过转录组测序（RNA-seq）、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫印迹和免疫荧光等技术阐明NF-κB信号激活机制。

研究结果

跑步血浆促进成年小鼠MI后心脏再生

接受RP的小鼠在MI后28天表现出心功能显著改善（射血分数EF%、缩短分数FS%提高，左心室内径缩小），Masson三色染色显示瘢痕面积大幅减小，MI后14天梗死边缘区心肌细胞增殖标志物Ki67和磷酸化组蛋白H3（PH3）表达增加。

Clusterin作为关键外泌因子介导跑步血浆诱导的心肌细胞增殖

蛋白质组学鉴定出151个上调蛋白和506个下调蛋白，结合UniProt数据库“细胞增殖”功能注释筛选出13个重叠候选蛋白，其中Clusterin在体外表现出最强的促增殖效应。用Clusterin中和抗体处理RP后，其促进心肌细胞增殖、改善心功能和减少瘢痕的效果均被消除。

Clusterin对MI后心脏再生至关重要

心脏特异性Clu敲除小鼠在MI后心功能恶化、瘢痕增大、增殖心肌细胞减少。AAV9介导的Clusterin心肌过表达则显著改善心功能、缩小瘢痕、增加Ki67和PH3阳性心肌细胞数量。重组Clusterin（rCLU，1 mg/kg，尾静脉注射）同样促进心功能恢复、减少瘢痕、增加增殖心肌细胞。MADM谱系示踪实验证实rCLU处理增加了完成胞质分裂的单色标记心肌细胞比例，且该比例与射血分数正相关、与梗死面积负相关。

Clusterin通过NF-κB信号激活促进心肌细胞增殖

转录组分析显示rCLU处理后NF-κB信号通路最为富集，下游细胞周期调节因子上调。rCLU处理30分钟即可诱导p65核转位，该效应被NF-κB拮抗剂JSH-23或p65 siRNA敲低所阻断。Clusterin与IκBα共定位并通过Co-IP验证直接结合，促进IκBα与E3泛素连接酶β-TrCP结合，经由泛素-蛋白酶体途径加速IκBα降解（MG132可阻断），从而释放并激活NF-κB。

肝脏是运动后血浆Clusterin升高的主要来源

运动显著增加肝脏而非骨骼肌或心脏中的Clusterin表达。肝细胞特异性Clu敲除（AAV8-TBG-Cre）几乎完全消除了运动诱导的血浆Clusterin升高。

肝脏来源的Clusterin是运动血浆介导心脏再生的必要条件

AAV8-shCLU敲低肝脏Clusterin后，运动血浆中Clusterin水平升高被抑制，其对MI后心功能改善、瘢痕缩小和心肌细胞增殖的促进作用也随之消失。

讨论与结论

本研究从“肝脏-心脏交互作用”的新视角揭示了运动促进心肌细胞增殖的机制。先前研究已表明长期运动可增强心肌细胞增殖并预防MI后心力衰竭，但潜在机制不清。本研究通过异源运动血浆移植策略，克服了临床指南限制MI后早期运动的障碍，证实重复给予运动血浆可显著改善MI后心功能。通过蛋白质组学和功能筛选，确定Clusterin是运动诱导心脏再生的关键介质。

Clusterin主要以分泌型（sCLU）形式存在，具有分子伴侣和细胞保护功能。本研究发现sCLU不仅具有抗凋亡作用，更能直接促进心肌细胞增殖。机制上，Clusterin通过LRP2受体经网格蛋白介导的内吞进入心肌细胞，作为支架蛋白加速IκBα与SCF^β-TrCP的结合，促进IκBα的蛋白酶体降解，从而激活NF-κB信号。这与先前在前列腺细胞中观察到的机制一致。值得注意的是，虽然既往报道心肌细胞来源的Clusterin可通过TLR4调控巨噬细胞极化，本研究聚焦于Clusterin对心肌细胞的直接促增殖效应。

利用单细胞测序数据（人肝脏细胞图谱和人心脏图谱）分析显示，肝脏中Clusterin表达水平显著高于心脏，肝细胞和胆管细胞是肝脏中Clusterin的主要来源，而心脏中心肌细胞Clusterin表达较低，进一步支持运动后血浆Clusterin升高主要源于肝脏释放。

研究结论总结

本研究从“肝脏-心脏交互作用”的角度，阐明了运动通过诱导肝脏分泌Clusterin进入血液循环，经LRP2受体介导的内吞进入心肌细胞，通过结合IκBα并促进其泛素-蛋白酶体降解激活NF-κB信号，上调细胞周期相关基因表达，最终促进心肌细胞增殖和MI后心脏再生的完整机制。研究将Clusterin定位为MI后心力衰竭的潜在治疗靶点。