《Journal of Inflammation Research》：Integrative Bulk and Single-Cell Transcriptomic Analyses Identify NFKBIE as a Candidate Gene Associated with IS-II Neutrophil Differentiation in Lung Ischemia-Reperfusion Injury
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目的：接受肺移植的患者可能发生肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI），其中中性粒细胞参与炎症反应。然而，与不同中性粒细胞状态相关的分子特征仍未完全阐明。本研究旨在鉴定与免疫抑制-II（immunosupp
目的：接受肺移植的患者可能发生肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI），其中中性粒细胞参与炎症反应。然而，与不同中性粒细胞状态相关的分子特征仍未完全阐明。本研究旨在鉴定与免疫抑制-II（immunosuppressive-II，IS-II）中性粒细胞状态相关的候选分子特征，特别关注NF-κB抑制剂NFKBIE。
方法：研究人员整合了批量转录组和单细胞RNA测序数据。通过共表达分析和机器学习方法鉴定候选基因。进一步利用拟时序分析和计算性基因扰动检验细胞间通讯以及NFKBIE与中性粒细胞状态的关联。研究人员在LIRI小鼠模型中通过RT-qPCR和Western blotting验证NFKBIE表达，并通过组织学检查评估肺损伤。
结果：共鉴定出553个差异表达基因及一个含4,456个基因的关键疾病相关模块，主要富集于炎症和免疫相关通路（如TNF和NF-κB）。鉴定出五个重叠的候选转录组标志物：CXCL3、CYLD、NFKBIE、SLC30A1和KBTBD8。五基因模型在发现队列中显示出强判别能力（AUC = 0.986），在独立的GSE127003验证数据集中也显示出强判别能力（AUC = 0.999，95% CI 0.996–1.000）。单细胞分析显示，在CIT和再灌注后样本中，中性粒细胞均为最大的注释细胞群体，而IS-II中性粒细胞亚型在再灌注后显著富集；NFKBIE在IS-II中性粒细胞中表达最高。拟时序轨迹分析进一步表明，NFKBIE表达升高与向IS-II表型分化的较晚状态相关，而计算性NFKBIE扰动预测了多个扰动相关基因的改变。体内验证证实，再灌注后肺组织中NFKBIE mRNA和蛋白水平均上调。
结论：五基因转录组模型在独立验证数据集中显示出可重复的判别性能。NFKBIE在多项计算分析中始终与IS-II中性粒细胞状态相关，而体内实验证实其在再灌注后表达增加。这些发现提名NFKBIE为与IS-II中性粒细胞分化相关的候选基因，并为进一步的功能研究提供了假设生成的依据。
一、研究背景与问题
肺缺血再灌注损伤（LIRI）是肺移植、体外循环手术及严重胸部创伤后常见的危及生命状况，也是原发性移植物功能障碍（PGD）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的重要诱因。其病理生理机制复杂，主要表现为再灌注时氧化应激的骤然爆发、无菌性炎症级联放大以及固有免疫细胞快速浸润肺泡和间质区室。尽管近年来器官保存策略和离体肺灌注（EVLP）技术取得显著进展，LIRI相关的发病率和死亡率仍居高不下。中性粒细胞作为LIRI急性炎症反应中最先被募集到损伤肺微环境的髓系细胞之一，对疾病发展具有双重效应。传统上中性粒细胞被视为相对均一的终末分化细胞群体，主要产生活性氧（ROS）和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）清除病原体，同时加剧组织屏障破坏。然而，随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）的广泛应用，越来越多的证据表明中性粒细胞在稳态和病理条件下均表现出显著的转录可塑性和功能异质性。近期一项全面的中性粒细胞单细胞图谱将中性粒细胞分为多种转录和功能状态，包括两种免疫抑制状态IS-I和IS-II。IS-II中性粒细胞以免疫抑制和血管生成转录程序为特征，高表达VEGFA和免疫检查点分子CD274（PD-L1）。在健康肺组织中IS-I而非IS-II是主要免疫抑制状态，而IS-II在肿瘤等病理条件下更为突出，表明这些状态受组织和疾病背景塑造。NF-κB信号是再灌注炎症反应的核心组成部分，其负反馈调节因子可能为中性粒细胞对炎症微环境的反应提供分子读数。NFKBIE（即NF-κB抑制剂epsilon或IκBε）是IκB家族重要成员，通过结合NF-κB复合物并阻止其核转位，主要作为免疫激活和炎症反应的负反馈调节因子。然而其在急性肺损伤特别是LIRI诱导的中性粒细胞重编程和极化中的具体生物学作用尚未被系统研究。
二、研究内容与结论
本研究采用整合批量转录组和scRNA-seq数据的分析策略。首先利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）和机器学习方法优先鉴定出五个与再灌注损伤相关的候选转录组标志物，包括NFKBIE。随后在单细胞分辨率下表征LIRI微环境中的中性粒细胞异质性和细胞通讯。后续分析通过拟时序轨迹分析、细胞间通讯分析和计算性扰动检验NFKBIE表达与IS-II中性粒细胞状态的关联。最后在LIRI小鼠模型中检验再灌注相关的NFKBIE表达变化。研究发现IS-II中性粒细胞亚型在再灌注后显著富集，NFKBIE在IS-II中性粒细胞中表达最高，且其高表达与IS-II分化轨迹中较晚的拟时序状态相关。五基因模型在发现队列和独立验证数据集中均显示出强判别能力。体内实验证实再灌注后肺组织中NFKBIE mRNA和蛋白水平均上调。这些发现提名NFKBIE为与IS-II中性粒细胞分化相关的候选基因，为后续功能研究提供了假设生成的基础。
三、主要关键技术方法
研究使用了多个公开批量转录组数据集：GSE145989（含67例冷缺血保存末期和67例再灌注后1-2小时肺组织样本）和GSE18995（含18例保存后移植前和17例移植后样本），经探针注释、合并及ComBat算法批次校正后形成85例CIT和84例再灌注样本的综合队列。GSE127003（46例配对样本，共92例）作为独立验证数据集。单细胞数据集GSE220797含6例CIT和6例再灌注后样本。主要方法包括：limma差异表达分析；WGCNA共表达模块鉴定；STRING和Cytoscape构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络；LASSO回归和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）机器学习特征选择；Seurat流程进行单细胞聚类和注释；Monocle2拟时序轨迹分析；CellChat细胞通讯分析；scTenifoldKnk计算性基因扰动；CIBERSORT免疫细胞浸润分析；SHAP模型可解释性分析；以及小鼠LIRI模型中的RT-qPCR和Western blotting验证。
四、研究结果
LIRI相关DEGs的鉴定：通过整合GSE145989和GSE18995数据集，经ComBat批次校正后，以|log?FC| > 0.5和校正P < 0.05为阈值鉴定出553个DEGs，其中456个上调、97个下调。TNFAIP3、PMAIP1、CSF3、CXCL8、IL6等炎症相关基因显著上调。
WGCNA鉴定关键疾病相关模块：基于批次校正后的10,378个基因，以软阈值为3构建共表达网络，鉴定出15个共表达模块。turquoise模块与再灌注表型呈最强正相关（r = 0.76，P < 0.001），含4,456个基因，被选为核心疾病相关模块。
功能富集分析：553个DEGs与turquoise模块的4,456个基因交集获得448个重叠基因。KEGG分析显示显著富集于TNF信号、NF-κB信号、C型凝集素受体信号、凋亡和JAK-STAT等炎症免疫相关通路。GO分析显示生物学过程主要富集于对细菌来源分子和脂多糖的反应，细胞组分富集于三级颗粒，分子功能富集于细胞因子活性。
单细胞转录组分析揭示LIRI细胞异质性：经质量控制后鉴定出23个细胞簇，注释为七种主要细胞类型：中性粒细胞、I型肺泡上皮细胞（AT1）、II型肺泡上皮细胞（AT2）、T细胞、巨噬细胞、单核细胞和纤毛细胞。中性粒细胞在两组中均为最大细胞群体（CIT 51.57%，再灌注46.28%）。再灌注组AT1相对比例从12.14%升至20.88%。标记基因聚类为C1-C6六个功能模块，分别富集于细胞杀伤、中性粒细胞趋化、抗原加工呈递、纤毛运动等生物学过程。
中性粒细胞亚型鉴定：对中性粒细胞进行二次聚类获得15个细胞簇，注释为六种中性粒细胞状态：IS-I、IS-II、IFN-response、antigen-presentation、immuno-silent和PreNeu。IS-II亚型在再灌注后从20.35%显著增至51.24%，成为再灌注后最丰富的亚型。IS-II相关DEGs与批量DEGs方向一致的交集获得93个候选基因（82个上调、11个下调）。
机器学习和PPI网络鉴定五个候选转录组标志物：基于93个重叠基因构建PPI网络（89个节点、172条边），经MCC算法筛选出前50个枢纽蛋白。LASSO回归鉴定出12个特征基因，SVM-RFE鉴定出24个候选基因，两者交集获得五个共同关键基因：CXCL3、CYLD、NFKBIE、SLC30A1和KBTBD8。
五基因模型在独立验证数据集中显示可重复判别能力：基于五个基因构建的logistic回归列线图模型在发现队列中AUC达0.986（95% CI 0.970–0.986），校准曲线拟合良好。决策曲线分析显示联合模型净收益优于单基因模型。SHAP分析显示NFKBIE对模型预测贡献最大（平均绝对SHAP值0.120）。在GSE127003验证数据集中，五基因模型AUC达0.999（95% CI 0.996–1.000），五个单基因AUC分别为CXCL3 0.898、CYLD 0.901、NFKBIE 0.979、SLC30A1 0.950、KBTBD8 0.901。
免疫细胞浸润相关性和NFKBIE通路富集分析：CIBERSORT分析显示CIT和再灌注组间22种免疫细胞亚型浸润比例存在差异。五个基因的表达与中性粒细胞浸润均呈正相关，与静息记忆CD4?T细胞和M2巨噬细胞呈负相关。基于NFKBIE表达的单基因GSEA显示，NFKBIE高表达组显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号、JAK-STAT信号、趋化因子信号和移植物抗宿主病等通路，而药物代谢-细胞色素P450等代谢通路下调。
拟时序轨迹、细胞通讯和计算性扰动分析表征NFKBIE与IS-II状态的关联：NFKBIE在IS-II中性粒细胞中表达最高，NFKBIE-high IS-II细胞主要集中于IS-II簇核心区域。拟时序分析显示IS-II亚型主要位于高拟时序值的末端分支，NFKBIE-high细胞比NFKBIE-low细胞更接近拟时序终点。细胞通讯分析显示再灌注组IFN-response中性粒细胞是最强信号发送者，IS-II与IFN-response间通讯强烈。再灌注组配体-受体相互作用对为3,429对（较对照组减少292对），但总体通讯强度增加1.25倍。计算性NFKBIE敲低鉴定出多个显著扰动基因，最显著者为DRC1、C20orf85、TNFRSF12A、SPI1和ARHGDIB。
小鼠LIRI模型验证NFKBIE表达：小鼠LIRI模型显示I/R组出现明显肺泡间隔破坏、炎症细胞浸润和血管周围水肿，BALF蛋白水平升高，氧合指数降低，确认模型建立成功。RT-qPCR和Western blotting显示I/R组NFKBIE mRNA和蛋白表达均较对照组显著上调。
五、讨论与结论
讨论部分指出，本研究的主要贡献是在单细胞水平表征了LIRI中的中性粒细胞状态，并发现IS-II中性粒细胞群体在再灌注后显著富集。NFKBIE被鉴定为与IS-II状态相关的候选基因，而非新确立的NF-κB信号或中性粒细胞分化调节因子。研究识别出的分子特征应置于再灌注损伤中已确立的NF-κB反应的背景下解读，NFKBIE和CYLD是已知的NF-κB信号负调节因子，其富集可能部分反映再灌注后NF-κB相关反馈程序的激活。NFKBIE高表达与IS-II分化轨迹中较晚的拟时序状态相关，鉴于NFKBIE作为NF-κB负反馈调节因子的既定作用，其表达升高也可能代表对再灌注后增强的炎症性NF-κB活性的补偿性反应。细胞通讯分析显示LIRI后细胞间通讯网络被重塑，信号更集中和强化。计算性扰动预测NFKBIE相关网络与中性粒细胞分化、迁移和功能相关，但未经功能扰动实验不能推断直接调控关系。
研究结论为：五基因转录组模型在独立验证数据集中显示出可重复的判别性能。NFKBIE在多项计算分析中始终与IS-II中性粒细胞状态相关，体内实验证实其在再灌注后表达增加。这些发现提名NFKBIE为与IS-II中性粒细胞分化相关的候选基因，并为进一步功能研究提供了假设生成的依据。
