基于Kayvirus噬菌体RuSa1的金黄色葡萄球菌下呼吸道感染传感检测及临床菌株前噬菌体分类解析

《Viruses》：Kayvirus-Based Sensing of Lower Respiratory Tract Infection and Taxonomic Dissection of Prophages in Clinical Strains of Staphylococcus aureus

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是归属于ESKAPE（由屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属组成的重点病原体群）的主要致病菌种之一，常在下呼吸道感染（lower respiratory tract infections，LRTI）中检出。研究人员探究了金黄色葡萄球菌噬菌体RuSa1作为生物报告器（bioreporter）用于人呼吸道金黄色葡萄球菌感染的适用性，并以铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）为参照评估金黄色葡萄球菌临床菌株的前噬菌体（prophage）图谱，以服务于安全的噬菌体治疗。基于BOX-A1R的重复基因外回文聚合酶链反应（repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction，BOX-PCR）在痰样本中显示出对应葡萄球菌属（Staphylococcus）的离散特征，而RuSa1特异性地识别LRTI中的金黄色葡萄球菌。泛基因组（pangenome）分析揭示，在金黄色葡萄球菌临床菌株（n = 50）中，作为前噬菌体的穿孔素（holin）和主要衣壳蛋白（major capsid proteins，MCP）普遍存在。Peeveelvirus、Biseptimavirus、Dubowvirus和Triavirus是金黄色葡萄球菌中的主要溶原性分类群，而未发现与Kayvirus样前噬菌体对应的遗传特征。金黄色葡萄球菌中前噬菌体的丰度和均匀度较高，而铜绿假单胞菌中多样性和丰富度达到峰值。有趣的是，穿孔素在金黄色葡萄球菌中特别表现出较高的多样性、丰度、丰富度和均匀度。相反，尾蛋白（tail proteins）在铜绿假单胞菌中表现出较高的多样性、丰度和丰富度，而其分布在金黄色葡萄球菌中更为均匀。研究人员在RuSa1中鉴定出一种尾纤维蛋白（tail fibre protein），该蛋白与金黄色葡萄球菌的壁磷壁酸（wall teichoic acids，WTA）表现出强结合（结合能?8.1 kcal/mol），其次为金黄色葡萄球菌ST395（结合能?7.2 kcal/mol）。该研究证明了RuSa1感知并裂解呼吸道金黄色葡萄球菌的潜在能力，并解析了前噬菌体的分类学图谱，这有助于推动Kayvirus在针对LRTI中金黄色葡萄球菌的诊断和治疗中的安全应用。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是ESKAPE（由屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属组成的重点病原体群）中的主要致病菌之一，常涉及下呼吸道感染（lower respiratory tract infections，LRTI）。其致病性受前噬菌体（prophage）影响，前噬菌体可占其基因组的10%，且90%的分离株至少携带一个前噬菌体；前噬菌体可作为毒力、抗菌药物耐药（antimicrobial resistance，AMR）和噬菌体抗性基因的储存库，并通过溶原转换促进细菌进化与适应。金黄色葡萄球菌生物膜形成和抗生素耐药使传统治疗面临困难，噬菌体治疗成为替代方向；但RuSa1能否感知和裂解呼吸道金黄色葡萄球菌尚不确定，且Kayvirus遗传物质是否可能整合入金黄色葡萄球菌基因组仍不明确。因此，研究人员以RuSa1为裂解性Kayvirus代表，研究其对LRTI来源金黄色葡萄球菌的传感与裂解能力，并解析金黄色葡萄球菌临床菌株前噬菌体的分类学格局，与铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）比较，进一步鉴定RuSa1尾纤维蛋白与金黄色葡萄球菌壁磷壁酸（WTA）的相互作用，以评估其诊断和治疗应用潜力。

关键技术方法（不超过250字）：临床菌株来自人LRTI痰样本，包括S. haemolyticus、S. epidermidis和S. aureus分离株，并以ATCC BAA-44为参照；RuSa1此前分离自Sambar deer围栏水样并以ATCC BAA-44扩增。采用BOX-PCR（repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction）基因分型、Vitek 2 GP ID生化鉴定、斑点试验、噬菌斑试验和吸附试验评估裂解活性，并结合光镜与透射电镜观察。前噬菌体分析纳入NCBI临床金黄色葡萄球菌（n = 50）和铜绿假单胞菌（n = 50）基因组，经RAST（Rapid Annotations using Subsystems Technology）注释、BLAST比对UniProt参考序列、热图聚类和α多样性指数比较。对RuSa1尾纤维蛋白进行注释、系统发育分析、AlphaFold3/protenix建模，并以HADDOCK 2.4（High Ambiguity Driven Biomolecular DOCKing）进行与WTA的分子对接。

研究结果：
3.1 RuSa1感知并裂解源自LRTI的多种金黄色葡萄球菌。通过BOX-PCR、斑点试验和噬菌斑试验，痰样本葡萄球菌分离株显示离散DNA指纹；RuSa1仅对金黄色葡萄球菌产生清晰裂解区，对S. haemolyticus和S. epidermidis敏感性差；噬菌斑数随稀释度增加而减少，提示RuSa1对LRTI金黄色葡萄球菌具有传感和裂解潜力。
3.2 临床金黄色葡萄球菌前噬菌体呈对比性分布。通过RAST注释50株金黄色葡萄球菌基因组，在48个基因组中鉴定729个前噬菌体，2株缺乏前噬菌体，Gv69最多（n = 37）；噬菌体裂解模块最多（n = 227，31.1%），其次为包装机器（n = 220，30.2%）、复制（n = 152，20.9%）和衣壳蛋白（n = 117，16%），尾蛋白和内含子最少。
3.3 临床金黄色葡萄球菌前噬菌体的结构与功能特征。通过前噬菌体蛋白鉴定，共发现84个穿孔素和66个MCP，Gv69和NMR08穿孔素最多（各n = 4），Gv69和103744的MCP最多（各n = 3）；尾蛋白仅8个，几乎缺失于所有基因组，仅见于11819-97和Gv88，提示穿孔素和MCP在金黄色葡萄球菌前噬菌体中占优。
3.4 临床金黄色葡萄球菌前噬菌体的分类学格局。通过holin、MCP和尾蛋白序列分类，前噬菌体均属Caudoviricetes；穿孔素以Peeveelvirus（26.5%）、Biseptimavirus（22.4%）、Dubowvirus（20.0%）、Triavirus（15.3%）和Phietavirus（14.7%）为主；MCP以Biseptimavirus（54.5%）和Triavirus（36.4%）为主；尾蛋白以Triavirus和Dubowvirus为主（各33.3%）；未发现与Kayvirus RuSa1的holin、MCP或尾蛋白显著匹配。
3.5 临床金黄色葡萄球菌前噬菌体的聚类热图分析。通过聚类热图，前噬菌体形成两个进化枝：进化枝1富含噬菌体裂解模块、包装机器和复制蛋白，进化枝2为中度至低度优势；菌株分组显示地理分离，group 1以欧洲（64.28%）为主，group 2以亚洲（47.22%）为主。
3.6 临床金黄色葡萄球菌主要前噬菌体的分类学身份。通过地理分组后的分类分析，group 1穿孔素以Biseptimavirus和Peeveelvirus为主（各25%），group 2以Peeveelvirus为主（27.52%）；两组MCP均以Biseptimavirus为主（56.52%和53.66%），其次为Triavirus；尾蛋白仅见于group 2，属Triavirus和Dubowvirus（各33.33%），提示欧洲和亚洲菌株前噬菌体分布异质。
3.7 金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌前噬菌体比较分析。通过12种前噬菌体蛋白比较，8种（66.7%）为两者共有，4种（33.3%）为铜绿假单胞菌独有，无金黄色葡萄球菌独有蛋白；IbrA、IbrB、DNA合成、基板蛋白和尾纤维蛋白为铜绿假单胞菌独有。22个属中16个（72.7%）属铜绿假单胞菌，5个（22.7%）属金黄色葡萄球菌；Biseptimavirus、Triavirus、Peeveelvirus、Dubowvirus和Phietavirus为金黄色葡萄球菌独有，另有多属为铜绿假单胞菌独有。
3.8 金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌前噬菌体多样性指数。通过α多样性分析，铜绿假单胞菌的Shannon–Wiener/Simpson多样性和Margalef丰富度较高，金黄色葡萄球菌的丰度和Pielou均匀度较高；MCP呈相似趋势；穿孔素的多样性、丰度、丰富度和均匀度均在金黄色葡萄球菌中较高；尾蛋白多样性、丰度和丰富度在铜绿假单胞菌中较高，而均匀度在金黄色葡萄球菌中较高。
3.9 RuSa1中与金黄色葡萄球菌相互作用的尾纤维蛋白鉴定。通过BLAST、最大似然系统发育和结构建模，鉴定NTF1、NTF2和NTF3三个尾纤维蛋白；NTF1与已知金黄色葡萄球菌噬菌体聚为一类，NTF2和NTF3形成较远谱系；三者与phi812噬菌体相应蛋白序列一致性分别达91.7%、99.7%和98.7%，推断NTF1和NTF2为同源三聚体、NTF3为单体，模型pLDDT多大于70，NTF1顶端环区pLDDT较低，可能具有柔性。
3.10 RuSa1尾纤维蛋白与WTA的分子对接。通过HADDOCK 2.4对接NTF1三聚体与WTA，NTF1与金黄色葡萄球菌WTA结合强于ST395 WTA，结合自由能分别为?8.1 kcal/mol和?7.2 kcal/mol；金黄色葡萄球菌WTA复合物界面面积更大（893.3 ?² vs. 735.8 ?²），氢键更多（3 vs. 2），并形成磷酸基团与NTF1 R412的盐桥，提示结合更稳定、更具特异性。

讨论部分总结：讨论指出，RuSa1先前对糖尿病足感染MRSA的裂解能力已显示，本研究将其扩展至呼吸道金黄色葡萄球菌；前噬菌体参与细菌适应、适合度、遗传多样性、毒力和致病性。不同研究前噬菌体计数差异与分析工具和菌株有关；本研究发现holin和MCP占优，尾纤维蛋白仅存在于少数基因组，且未发现Kayvirus遗传元件整合。分类上，Peeveelvirus、Biseptimavirus、Dubowvirus、Triavirus和Phietavirus属Caudoviricetes，部分属归属Bronfenbrennervirinae、Azeredovirinae，Triavirus科/亚科未定；热图显示地理分离；比较分析显示铜绿假单胞菌独有IbrA/IbrB等蛋白，提示宿主特异性适应；α多样性趋势显示两菌种前噬菌体功能模块差异。WTA是主要受体，TarM/TarS糖基化影响噬菌体结合；对接显示金黄色葡萄球菌WTA与NTF1结合更稳定特异，ST395疏水接触较多但可能非特异；局限包括仅使用一个WTA重复单元、金黄色葡萄球菌样本量小、基于噬菌体相关蛋白分类，建议纳入更多呼吸道菌株并以完整前噬菌体区域分析，且需排除裂解噬菌体驱动水平基因转移风险。

研究结论翻译：总之，该研究证明了Kayvirus RuSa1感知并裂解LRTI来源金黄色葡萄球菌的潜在适用性。该研究进一步揭示了金黄色葡萄球菌前噬菌体独特的结构、功能和分类学格局，支持RuSa1在诊断和噬菌体治疗中的应用潜力。Peeveelvirus、Biseptimavirus、Dubowvirus和Triavirus是感染金黄色葡萄球菌的主要溶原性分类群。金黄色葡萄球菌中前噬菌体的丰度和均匀度较高，而铜绿假单胞菌中多样性和丰富度达到峰值。有趣的是，穿孔素在金黄色葡萄球菌中表现出较高的多样性、丰度、丰富度和均匀度，提示其在侵袭革兰阳性菌厚细胞壁中的关键作用。RuSa1尾纤维与金黄色葡萄球菌WTA的高结合亲和力，以及临床金黄色葡萄球菌基因组中缺乏Kayvirus样前噬菌体，为该噬菌体在LRTI诊断中的潜在应用提供了新维度。