《Biology》：Enhancing Keratinase Efficiency Through Computational Design and Site-Directed Mutagenesis for Keratin Waste Valorization
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来自Thermoactinomyces vulgaris TK1-21的角蛋白酶-I（keratinase-I）通过计算引导的定点突变（site-directed mutagenesis）进行工程化改造，以增强角蛋白水解（keratin hydrolysis）
来自Thermoactinomyces vulgaris TK1-21的角蛋白酶-I（keratinase-I）通过计算引导的定点突变（site-directed mutagenesis）进行工程化改造，以增强角蛋白水解（keratin hydrolysis）和角蛋白废弃物增值利用（keratin waste valorization）。重组角蛋白酶-I（recombinant keratinase-I, rK-I）在Bacillus subtilis RIK1285中表达，分子建模（molecular modeling）提示Leu214、Leu222、Ala270和Ser280为预测底物结合口袋（predicted substrate binding pocket）内的潜在残基。在工程化变体中，S280L表现出最高的催化性能，其对α-角蛋白（α-keratin）和β-角蛋白（β-keratin）的表观动力学参数（apparent kinetic parameters）分别较rK-I提高16.94%和19.52%。S280L还增强了对水热处理鸡毛（hydrothermally treated chicken feathers）的水解，产生的蛋白质（5.59 mg/mL）和肽（1.38 mg/mL）浓度高于rK-I（分别为4.73和1.08 mg/mL）。所得角蛋白水解物（keratin hydrolysate）表现出更高的DPPH和ABTS自由基清除活性（radical scavenging activities），分别达到23.85和1100 μmol TE/g蛋白质。LC-MS/MS鉴定出三种仅在S280L衍生水解物中检测到的肽：SEEGVPISSGGF、EGVPISSGGF和HLPGHQF。生物信息学分析（bioinformatic analysis）预测了这些肽的潜在生物活性。随后对合成肽的体外评估（in vitro evaluation）表明，HLPGHQF表现出79 ± 2.5%的ACE抑制活性和17 ± 0.5%的抗氧化活性，而EGVPISSGGF未检测到活性。这些发现表明，工程化改造rK-I的预测底物结合口袋可增强角蛋白水解并促进高附加值生物活性肽（value-added bioactive peptides）的生成。
角蛋白废弃物（如家禽羽毛）产量巨大且富含难以降解的角蛋白，其资源化利用长期面临技术瓶颈。角蛋白酶（EC 3.4.21/24/99.11）虽能降解角蛋白，但多数微生物来源的角蛋白酶对β-角蛋白活性较高而对α-角蛋白活性有限，且存在底物特异性不足、酶生产成本高和纯化复杂等问题，制约了工业应用。此外，角蛋白降解机制尚不清晰，随机突变策略存在局限，而底物结合口袋工程化改造能否同步提升角蛋白水解效率并影响水解产物中肽的释放谱，此前研究甚少。基于此，研究人员以Thermoactinomyces vulgaris TK1-21来源的角蛋白酶-I为对象，在大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α中完成质粒构建后于Bacillus subtilis RIK1285中异源表达，经超滤（ultrafiltration, UF）和Ni2+亲和色谱一步纯化获得重组角蛋白酶-I（rK-I），继而通过同源建模（homology modeling）和分子对接（molecular docking）预测底物结合口袋，选定Leu214、Leu222、Ala270和Ser280四个残基进行定点突变，筛选出催化性能提升的变体，并系统比较其生化特性、角蛋白水解效率及水解产物肽谱与生物活性。研究得出S280L变体催化效率最优，且在水解水热处理鸡毛时产生更多蛋白质和肽、更高抗氧化活性，并鉴定出具有ACE抑制活性的新肽HLPGHQF。该研究的重要意义在于证明了计算引导的底物结合口袋工程化改造不仅能提升角蛋白酶的催化性能，还可改变水解产物的肽谱，为角蛋白废弃物转化为高附加值生物活性肽提供了可行的生物催化剂和理性设计策略。
研究人员采用的关键技术方法包括：以T. vulgaris TK1-21基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增ker-I基因并利用Gibson Assembly?克隆入pBE-S载体，转化B. subtilis RIK1285实现异源表达；采用SWISS-MODEL服务器构建三维结构模型，CB-Dock 2进行分子对接以预测底物结合口袋并筛选有利突变体；通过一步PCR法定点突变结合DpnI消化构建变体库；采用Ni2+亲和色谱纯化酶蛋白，以AAPF为合成底物测定催化效率（kcat/Km），以羽毛角蛋白（β-keratin）和羊毛粉（α-keratin）为底物测定表观动力学参数；利用LC-MS/MS结合PEAKS X Pro软件（数据库限定Gallus gallus）鉴定水解产物肽序列，并以PeptideRanker、BIOPEP、ToxinPred和AllerTOP进行生物信息学预测；最后对合成肽进行ACE抑制和DPP-IV抑制等体外生物活性评价。样本来源为T. vulgaris TK1-21（GenBank accession no. MZ854205.1）基因组DNA，表达宿主B. subtilis RIK1285购自Takara Bio Inc.。
研究结果如下：
3.1 重组角蛋白酶-I（rK-I）的生产：ker-I基因开放阅读框（open reading frame, ORF）为1167 bp，编码389个氨基酸的前体-前导-成熟蛋白，信号肽预测为前31个残基，成熟蛋白始于Ala107，催化三联体为Asp148、His181和Ser354。重组B. subtilis/pBE-S/ker-I在含1.0%脱脂奶粉的LB琼脂上产生水解圈，粗酶最大角蛋白水解活性为1.31 ± 0.07 U/mL。经10 kDa超滤和Ni2+亲和色谱纯化后，比活性达37.22 U/mg，纯化倍数32.3倍，回收率54.04%，SDS-PAGE显示约28 kDa单一条带。纯化rK-I最适pH为9.5，在pH 6–11范围内稳定（4 °C孵育24 h保留80%以上活性）；最适温度为65 °C，在55–65 °C孵育240 min保留50%以上活性。
3.2 突变位点的选择：分子对接显示rK-I与AAPF的对接评分为?5.7 kcal/mol，选择Leu214、Leu222、Ala270和Ser280为候选突变位点，对接评分低于?5.7 kcal/mol的变体包括L214H、L214Y、L214T、L214I、L222S、L222T、L222V、A270P、A270Y、A270T、A270L、S280T、S280C、S280L和S280V。
3.3 预测底物结合口袋的定点突变：L214I、L222V、S280C、S280L和S280V对β-角蛋白的相对活性显著高于rK-I，分别达161.96 ± 5.45%、126.00 ± 4.98%、132.22 ± 5.17%、170.45 ± 6.59%和146.78 ± 4.14%。以AAPF测定催化效率，rK-I的kcat/Km为77.18 mM?1 s?1，上述变体分别为91.8、82.4、108.9、123.4和94.0 mM?1 s?1，其中S280L最高，约为rK-I的1.60倍。各变体最适温度均为65 °C，rK-I、L214I、S280C和S280L的半衰期均为180 min，L222V和S280V分别为130和160 min；最适pH和pH稳定性无显著差异。结构建模显示Leu280位于预测底物结合口袋内，靠近AAPF的苯丙氨酸侧链，提示潜在疏水相互作用。以α-和β-角蛋白为底物，S280L的Vmax/Km分别为4.83和7.59，较rK-I的4.13和6.35分别提高16.94%和19.52%。
3.4 角蛋白水解物的分级与鉴定：S280L水解水热处理鸡毛产生的蛋白质和肽浓度均高于rK-I，72 h时分别为5.59和1.38 mg/mL（rK-I为4.73和1.08 mg/mL）；S280L衍生水解物的DPPH和ABTS自由基清除活性分别达23.85和1100 μmol TE/g蛋白质（rK-I为20.90和996 μmol TE/g蛋白质），两种酶的水解物抗氧化活性在48 h后均下降。超滤结合Sephadex G-25色谱显示两种水解物均有三个主要组分（F1、F2、F3）。LC-MS/MS鉴定肽分子量范围为765–1379 Da，SEEGVPISSGGF、EGVPISSGGF和HLPGHQF三种肽仅在S280L衍生水解物中检出，其抗氧化相关氨基酸残基比例分别为8.33%、10.00%和42.85%；BIOPEP预测这些肽具有ACE抑制、DPP-IV抑制、抗遗忘、抗血栓、肾素抑制和PAM抑制等潜在活性，ToxinPred和AllerTOP预测其为非毒性且可能非致敏。
3.5 合成肽的体外生物活性：HLPGHQF在测试浓度下表现出79 ± 2.5%的ACE抑制活性和17 ± 0.5%的抗氧化活性，未检测到DPP-IV抑制活性；EGVPISSGGF在测试条件下未检测到活性。
讨论部分总结：序列分析证实角蛋白酶-I为枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶（subtilisin-like serine protease），前导肽可能参与酶的正确折叠并防止成熟前过早蛋白水解。重组表达系统简化了纯化流程，仅需超滤和Ni2+亲和色谱两步即获54.04%回收率，而野生型酶需四步纯化且回收率仅21%。rK-I的pH和温度特性与野生型酶基本一致。S280L活性提升可能与极性丝氨酸被疏水性亮氨酸取代有关，结构建模提示Leu280靠近底物苯丙氨酸残基而有利于疏水相互作用，但该机制尚需结构或实验验证。与KerSMD等研究一致，底物结合口袋突变可影响催化效率和热稳定性。S280L在保持热稳定性和pH稳定性的同时催化效率提升，支持其用于角蛋白水解。抗氧化活性在48 h后下降而蛋白质和肽浓度持续增加，提示抗氧化活性取决于肽谱而非单纯肽总量，48 h为在所考察条件下最大化抗氧化活性的适宜水解时间。仅S280L衍生水解物中检出独特肽，提示底物结合口袋改造可能改变了裂解模式；但in silico预测与实验活性存在差异（如EGVPISSGGF预测有活性而实测无），表明生物信息学预测适用于筛选但不等同于实测活性。HLPGHQF的ACE抑制活性与其His、Pro和芳香族Phe残基组成有关，其IC50和抑制机制尚待进一步定量评估。
研究结论部分翻译：本研究证明，对预测底物结合口袋进行计算引导的定点突变可提升角蛋白废弃物增值利用的催化性能。在工程化变体中，S280L对α-和β-角蛋白的表观Vmax/Km均增强，同时保留了rK-I的有利生化特性。S280L变体还改善了水热处理鸡毛的水解，导致肽产量和抗氧化活性增加。此外，LC-MS/MS分析揭示了S280L衍生角蛋白水解物中的独特肽，包括HLPGHQF，其在肽合成和体外验证后表现出ACE抑制和抗氧化活性。这些发现表明，改造rK-I的预测底物结合口袋不仅可影响表观Vmax/Km，还可影响角蛋白水解过程中产生的肽谱。总体而言，S280L代表了用于角蛋白废弃物增值利用及生产高附加值蛋白质水解物和生物活性肽的有前景的生物催化剂。
