《Agronomy》：Homozygosity for a Canonical FLNB Splice-Donor Variant and a Co-Inherited Missense Variant on a Single Haplotype in Spondylocarpotarsal Synostosis Syndrome: Neither Variant Can Receive Allelic Evidence Independently
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：脊柱腕跗骨融合综合征（SCT）是一种由FLNB基因双等位基因功能缺失变异（包括无义、移码、经典剪接位点及结构变异）所致的常染色体隐性骨骼发育异常。研究人员报道一例出生于近亲婚配家庭的6岁8个月女性患儿，表现为不成比例的矮身材及进行性脊柱侧凸，并接受临床、影像
：脊柱腕跗骨融合综合征（SCT）是一种由FLNB基因双等位基因功能缺失变异（包括无义、移码、经典剪接位点及结构变异）所致的常染色体隐性骨骼发育异常。研究人员报道一例出生于近亲婚配家庭的6岁8个月女性患儿，表现为不成比例的矮身材及进行性脊柱侧凸，并接受临床、影像学及外显子组测序评估。研究共鉴定出两个罕见FLNB变异：经典剪接供体变异NM_001457.4:c.4514+1G>C及错义变异c.6635C>T p.(Ala2212Val)。Sanger测序显示先证者均为纯合，而父母双方对两个变异均为杂合，提示两个变异位于同一祖先单倍型上，相距21,859 bp，并由父母双方共同传递。剪接供体变异被归类为致病性变异，可解释该表型。由于错义变异与剪接变异位于同一单倍型，等位基因证据（PM3）及表型特异性证据（PP4）不能独立归属于该错义变异，因此其仍为意义未明变异；对埋藏残基Ala2212的结构建模亦不构成功能性证据。影像学显示多节段椎体及后部结构融合、腕骨及跗骨联合，以及主要侧凸角度在12个月内由14度进展至35度。在近亲婚配家庭中，单个基因内两个罕见变异的纯合状态反映的是单一单倍型，两个变异均不能独立获得等位基因或表型证据。
论文主体解读：
一、研究背景与问题
FLNB基因定位于3p14.3，包含46个外显子，编码细丝蛋白B（filamin-B，NM_001457.4；NP_001448.2），一种含2602个残基的胞质蛋白。其结构具有模块化特征：N端肌动蛋白结合结构域由两个钙调蛋白同源亚结构域构成，随后为24个免疫球蛋白样细丝蛋白重复序列，其间由两个铰链区隔开，重复24与第二铰链区共同介导同源二聚化。细丝蛋白B将跨膜受体锚定至肌动蛋白细胞骨架，并在生长板软骨细胞及发育中椎体中表达，其功能缺失会破坏椎体分节、关节形成及骨骼发生。FLNB致病性变异导致两类机制不同的疾病：单等位基因错义替换及小片段框内缺失通过功能获得机制产生从Larsen综合征、3型干骺端发育不良至围产期致死性1型干骺端发育不良的梯度表型；而双等位基因功能缺失变异则导致脊柱腕跗骨融合综合征（SCT，OMIM 272460）。
SCT以出生时体型正常、随后出现由椎体融合驱动的出生后进行性不成比例矮身材为特征，同时伴有脊柱侧凸、脊柱前凸及腕骨和跗骨联合。腕骨骨化常延迟，腕骨联合可能仅在儿童后期显现。可变附加特征包括腭裂、听力损失、肋骨异常及颈椎不稳定；智力通常正常。表型模拟可由MYH3双等位基因变异及纯合RFLNA移码变异引起。
当前研究面临的一个较少被讨论的问题涉及近亲婚配家庭中隐性遗传病基因内两个罕见变异的鉴定。ACMG/AMP框架对每个变异分别分类，等位基因证据（PM3）和表型特异性证据（PP4）被归属于单个变异。然而在近亲婚配家庭中，两个罕见变异可能因位于同一祖先单倍型而被同时纯合。在此情况下，先证者的基因型和表型是对单倍型的观察，而非对任一变异本身的观察，两个变异均不能独立获得等位基因或表型证据。本研究报道一名患儿，该区分决定了其中一个变异的最终分类。
二、研究设计与方法
本研究经Ba?ak?ehir ?am and Sakura City Hospital非介入性临床研究伦理委员会批准。研究人员对先证者及父母进行临床和影像学评估，包括全脊柱、双手、双足、胸部及头颅X线摄影，辅以颈椎、胸椎和腰椎的计算机断层扫描及磁共振成像。Cobb角在相隔12个月的两次站立后前位X线片上测量。外显子组测序采用Twist Comprehensive Exome Solution试剂盒在MGI DNBSEQ-G400平台进行，读段比对至GRCh38，使用BWA-MEM2 v2.2.1、Picard v3.0和Genome Analysis Toolkit v4.6.1.0处理，并以HaplotypeCaller进行变异调用。变异以gnomAD v4.1.1、ClinVar、LOVD、OMIM和dbNSFP注释，以0.5%的次要等位基因频率过滤，并首先针对骨骼发育不良基因面板（FLNB、MYH3、RFLNA、GDF6、DLL3、HES7、LFNG、MESP2、RIPPLY2和TBX6）审查，随后在全基因组范围内针对表型审查。两个FLNB位点的基因型调用、读段深度和变异等位基因分数均从外显子组数据记录。使用bcftools roh从先证者的外显子组基因型调用纯合片段，以确定FLNB周围纯合片段的范围。两个变异均通过双向Sanger测序在先证者和父母中验证。由于父母各传递一个FLNB等位基因，儿童中的纯合状态结合父母双方对两个变异均为杂合，仅与两个变异位于同一染色体上的配置相容。RNA分析未进行，因该研究为回顾性研究，无法获得合适的新鲜血样用于RNA提取，亦无法建立成纤维细胞系；该变异的后果因此为预测而非观察。
剪接效应以SpliceAI、Pangolin和MaxEntScan预测，完全跳过外显子26（c.4391_4514）的后果通过计算机模拟翻译推导。p.(Ala2212Val)以REVEL、AlphaMissense、CADD、SpliceAI和Pangolin评估。变异分类遵循ACMG/AMP框架及ClinGen细化规则，证据以Tavtigian等人的积分系统组合（极强8分、强4分、中等2分和支持1分；致病性≥10分，可能致病性6至9分，意义未明0至5分）。PVS1遵循ClinGen功能缺失决策树和剪接建议，PM3遵循ClinGen反式建议。预先固定三条规则：仅REVEL计入PP3，使用校准阈值0.773（中等）和0.932（强）；不一致的预测因子被报告但不加权；群体数据库缺失仅作为PM2_Supporting应用。结构分析从AlphaFold模型AF-O75369-F1提取重复21（残基2188-2280）和重复20（残基2091-2185），以PyMOL v3.1.1诱变向导建模Val2212，以Shrake–Rupley算法计算相对溶剂可及性，以DynaMut2在NMR结构PDB 2EE6上预测稳定性变化。还进行了重复21对重复20的刚体对接计算，但因埋藏替换在固定骨架上无法改变分子表面，该计算在构造上无信息量，仅作为补充材料报告。
三、研究结果
临床发现：先证者为足月出生女婴，父母为一级表亲。出生体重3250 g，出生身长46 cm。14个月独立行走，12个月说出第一个词，认知发育和学业正常。6岁8个月时因矮身材和脊柱侧凸转诊至遗传学门诊。身高104.6 cm（?2.98标准差），体重20.5 kg（?0.5标准差），不协调反映了不成比例的、以躯干为主的生长缺陷。胸廓狭窄，无大关节脱位、腭裂或马蹄内翻足。听力评估正常，眼科、心脏、腹部和肾脏评估亦已进行。
影像学发现：脊柱显示多个胸椎和颈胸椎椎体丧失椎间隙并融合为块椎。融合不仅限于椎体：棘突和椎板在多个连续节段融合，其他节段存在棘突缺损，受累节段椎弓根间距增宽。多个椎体前后径减小并变扁，部分腰椎体存在中线裂。存在S形胸腰段脊柱侧凸。侧凸进展方面，首次检查（6岁时）主弯从T5至T10测量，Cobb角14度；12个月后（7岁时），主弯端椎迁移，弯度从T4至T11测量为35度。由于端椎不同，两次测量并非严格等效，变化报告为近似进展度量。21度/年的增加约为最大发表测量变异95%限值7.2度的三倍，因此进展不太可能仅由测量误差解释。颈椎CT显示C5至C6椎间隙狭窄最明显；颈椎MRI显示C5和C6前后径减小、棘突融合及C4至C5宽基底后部椎间盘突出。手和足：腕骨聚集伴正常腕骨间关节间隙丧失，腕骨骨化延迟且相对实际年龄紊乱。远端指骨宽而扁，第一掌骨短而粗壮。中足跗骨联合存在：舟骨、楔骨和骰骨表现为融合块，足弓僵硬。
分子发现：外显子组测序在先证者中鉴定出两个罕见FLNB变异，NM_001457.4:c.4514+1G>C和c.6635C>T p.(Ala2212Val)，在MYH3、RFLNA、GDF6或脊柱肋骨发育不良基因中未鉴定出致病性变异。两个变异在外显子组数据中均被调用为纯合，变异等位基因分数分别为0.98和0.97，读段深度分别为205和191。两个变异均不存在于gnomAD v4.1.1、ClinVar或LOVD中；c.4514+1G>C此前未被报道，为新变异，而c.6635C>T在NCBI dbSNP中记录为rs149086909。Sanger测序显示先证者对两个变异均为纯合，父母双方对两个变异均为杂合。由于父母各携带两个变异并向孩子传递一个FLNB等位基因，且孩子在两个位点均不携带参考等位基因，两个变异必须位于父母各自同一条染色体上，孩子必须从双方继承该染色体。因此两个变异位于同一祖先单倍型上，处于顺式配置。其基因组位置为NC_000003.12:g.58132932G>C和NC_000003.12:g.58154791C>T，相距21,859 bp。bcftools roh将两个FLNB变异置于染色体3上0.2 Mb的单一纯合片段内，从g.58008422延伸至g.58172251，涵盖整个FLNB基因。该片段由46个信息性外显子单核苷酸多态性定义，先证者在每个位点均为纯合。在父母至少一方为杂合的26个位点中，先证者的等位基因由父母双方携带。映射至UniProt结构后，c.6635C>T p.(Ala2212Val)位于细丝蛋白重复21（残基2188-2280），c.4514+1G>C去除中断密码子1505第二碱基之后的内含子供体位点；密码子1505位于细丝蛋白重复13。
剪接供体变异的预测后果：SpliceAI预测c.4514+1G>C破坏经典供体位点，供体丢失delta评分为1.00（?1 bp）。Pangolin独立预测同一供体剪接丢失，评分为0.88。SpliceAI-10k后果模型预测外显子26（124 bp编码外显子）跳跃，导致移码。MaxEntScan显示供体显著减弱，评分从野生型约10降至变异约2。CADD PHRED评分为33。外显子26包含124个编码核苷酸，对应c.4391_4514。因124不能被3整除，完全跳过该外显子会破坏阅读框。在模拟的外显子跳跃转录本中，第一个改变的氨基酸位于1464位，第一个提前终止密码子出现在1479位。外显子跳跃转录本预计经历无义介导的衰变，因外显子26位于最终外显子-外显子连接点上游较远处。PVS1以完全强度应用，依据为：变异消除不变的+1供体核苷酸；FLNB功能缺失是隐性SCT的既定机制；受影响外显子存在于MANE Select转录本中，且无已知的拯救性替代转录本绕过；预测的外显子跳跃产物发生移码并受无义介导衰变；SpliceAI或Pangolin未预测到可恢复阅读框的隐蔽供体位点（供体获得delta评分0.04）。每个预测结果均移除或截短蛋白质剩余的1097个残基，包括二聚化结构域。然而在缺乏RNA数据的情况下，分类基于预测而非观察到的后果。
Ala2212为埋藏核心残基：在AlphaFold模型中，重复21的平均pLDDT为73.1，重复20为72.1，残基2212的置信度为78.1。残基2212位于跨越残基2210至2214的β链内，该链也在FLNB重复21的实验NMR结构（PDB 2EE6）中解析。该残基几乎完全埋藏，溶剂可及表面积为7.2平方埃，相对可及性为0.056，处于由Val2210、Phe2214、Val2250、Tyr2252和Ile2253形成的疏水环境中。以最频繁旋转异构体建模缬氨酸且不进行弛豫，增加约51立方埃的侧链体积，并将3.2埃以内的重原子对从两个增至六个，最近距离从2.83埃降至2.41埃。疏水核心的过度堆积可降低蛋白质稳定性，但这些是对预测结构固定骨架的观察，由此无法推断任何稳定性损失的幅度。DynaMut2预测PDB 2EE6中A30V替换的稳定性变化为?0.27 kcal/mol，远低于该方法约1.02 kcal/mol的均方根误差，因此预测的大小和方向均不可靠；其作为与可能的小幅稳定性降低相容的计算观察报告，不作为功能缺失或致病性的证据。
变异分类：经典剪接供体变异NM_001457.4:c.4514+1G>C满足PVS1，因其消除FLNB中不变的+1供体核苷酸，而FLNB功能缺失是隐性SCT的既定机制，且每个预测的剪接后果均移除或截短蛋白质其余部分。PM2_Supporting满足，因该变异在所检查的群体数据库中缺失。PP4以支持强度应用，因先证者表现出特征性SCT表型，包括椎体融合、不成比例矮身材、脊柱侧凸、腕骨联合、腕骨骨化延迟和跗骨联合，且外显子组测序评估的主要表型模拟基因未提供替代诊断。等位基因证据（PM3）被考虑但未应用：基因内唯一其他罕见变异位于顺式位置，剪接供体变异的纯合状态是被解释的观察而非独立证据。PVS1、PM2_Supporting和PP4合计10分，c.4514+1G>C被分类为致病性。错义变异NM_001457.4:c.6635C>T p.(Ala2212Val)满足PM2_Supporting，因其在所检查的群体数据库中缺失，并因REVEL评分0.806超过校准阈值0.773而满足PP3中等强度。AlphaMissense给出不一致的、可能良性的评分0.27，按预先指定规则记录但不计入。PM3被考虑并排除：ClinGen定义要求变异与致病性或可能致病性变异反式检测，而此处两个变异位于顺式。通过纯合观察达到PM3的替代途径亦被关闭：错义变异的纯合性是携带另一个已解释表型的致病性变异的单倍型的纯合性，基于此授予等位基因证据将重复计算同一观察。同样，PP4不能归属于该变异。BP2（与致病性变异顺式观察）亦被考虑但未应用：在隐性基因中，与已预测为无效的等位基因共现使错义变异在该家族中的效应不可观察，而非提供反对其的证据。总计3分来自PM2_Supporting和PP3_Moderate，落在意义未明范围内。结构分析被视为机制性观察，不作为PS3功能性证据。p.(Ala2212Val)因此被分类为意义未明变异，其效应无法在该家族中评估。
先证者在已报道表型中的位置：先证者表现出在几乎所有汇集患者中存在的两个特征，即椎体融合和腕骨联合，以及矮身材、脊柱侧凸、腕骨骨化延迟和跗骨联合。不存在表征显性疾病的任何特征：无大关节脱位、无前额突出伴鼻梁凹陷和颧骨扁平、无腕骨或跗骨多余骨化中心。在基因确诊的FLNB相关SCT患者中，椎体融合和腕骨联合几乎存在于每个报道患者（各32/33），身高低于?2标准差见于所有16名报告身高的患者。已报道患者的等位基因几乎完全为无义、移码、经典剪接位点或结构变异。
四、讨论与结论
讨论部分指出，在近亲婚配家庭中，单个基因内两个罕见变异的纯合反映单一单倍型，先证者的基因型和表型是对单倍型的观察，两个变异均不能独立获得等位基因或表型证据。父母检测使该归属明确，应被视为证据生成而非确认。通过纯合观察达到PM3的途径因特定原因被关闭：同一单倍型在纯合状态携带独立满足PVS1并解释表型的经典剪接供体变异，错义变异位于已预测为无效的等位基因上，其纯合性不是关于错义变异的独立观察，而是单倍型纯合性的重述。与致病性变异顺式的变异不被免除，但也不能被归功：在该家族中其效应不可观察，任何计算或结构分析都不能将不可观察的等位基因转化为观察到的等位基因。
结构分析应在该背景下理解。该残基埋藏，相对溶剂可及性0.056，与免疫球蛋白样β三明治中的疏水簇紧密堆积；在此位置引入两个甲基增加模型中的短接触。这是怀疑轻度去稳定的合理基础，且与DynaMut2预测的方向一致，但幅度不一致。这不是功能性证据：模型由预测结构以单一旋转异构体且不弛豫构建，远低于预测因子误差的预测稳定性变化携带很少信息。
解决p.(Ala2212Val)将需要来自该家族之外的证据。在无关患者中与无效等位基因反式观察，或直接测量重组或患者来源突变重复21的稳定性和丰度，将是决定性的；两者目前均不可用。c.4514+1G>C为新变异，c.6635C>T仅在NCBI dbSNP（rs149086909）中记录而无临床断言；两个变异将提交至ClinVar，明确记录相位和纯合基因型，使顺式配置对后续遇到任一变异的任何实验室可见。
FLNB文献解释了为何该家族中可能预期致病性错义等位基因。在FLNB中，相同分子类别的变异根据作用位置和方式产生不同疾病：增强肌动蛋白结合的肌动蛋白结合结构域替换导致显性Larsen综合征或干骺端发育不良，而去稳定杆状结构域的替换预计表现为无效等位基因并促成隐性SCT。两个已发表观察提示隐性分支可能不限于早期截短蛋白质的等位基因：Qasim等人报道纯合错义等位基因c.209C>T p.(Pro70Leu)于单个近亲SCT家族，该变异位于显性功能获得替换聚集的CH1肌动蛋白结合结构域，其功能效应未检查，证据基础为一个家族；二聚化结构域移码p.(Ser2542Leufs82)保留大部分杆状结构域，也导致隐性SCT；纯合移码p.(Met2445Hisfs5)亦已被描述。去稳定远端杆状结构域的错义等位基因作为SCT病因在生物学上仍属合理，但本家族不能用于支持该假说。
将先证者与迄今报道的分子确诊家族并置支持三个观察。第一，FLNB谱系的隐性分支由预期消除蛋白质的等位基因组成，包括无义替换、产生移码的单核苷酸重复、6.2和6.4千碱基的多外显子缺失，以及现在的经典剪接供体变异。例外是纯合p.(Pro70Leu)替换，位于显性功能获得替换聚集的CH1肌动蛋白结合结构域；该结构域中错义等位基因如何产生隐性而非显性疾病，发表数据未解决，观察基于一个家族。第二，核心表型在很大程度上独立于患者携带的等位基因。椎体融合和腕骨联合几乎存在于每个报道患者，身高低于?2标准差见于所有报告身高的患者。相同核心特征描述于两个基因内缺失和当前剪接供体家族，因此表型似乎不追踪病变位置或类别。这是无残余功能梯度的功能缺失机制所预测的，且无一致的位置性基因型-表型相关性。这也意味着个体患者的严重程度不能从变异位置预期。第三，身高范围从?2.4至?5.1标准差，部分离散见于共享一种基因型的亲属之间，因此变异至少部分是年龄的函数，与融合在出生后继续且缺陷累积的机制一致。
听力损失具有实际后果。在15名报告听力的患者中，6名存在听力损失。先证者6岁8个月听力正常。数据不能建立自然史，但提示儿童早期听力正常不应排除后期损伤，因此安排年度听力学复查。颈椎受累方面，C5和C6前后径减小伴相应棘突融合及C4至C5宽基底椎间盘突出，将该儿童置于公认风险组。颈椎不稳定是SCT的已记录并发症，FLNB相关疾病在全身麻醉前推荐颈椎评估。因该人群中进展性脊柱侧凸常导致全身麻醉下手术伴气道操作，在择期手术前获取颈椎屈伸侧位X线片并每年复查颈椎。
转录本命名差异值得报告。p.(Ala2243Val)和p.(Ala2212Val)在其各自转录本上均正确，31残基偏移精确对应区分异构体8与MANE Select异构体的31氨基酸插入。比较p.(Ala2243Val)与NP_001448.2的读者在密码子2243发现不同残基，会合理推断描述错误。推荐报告FLNB变异的实验室明确说明转录本，且在不使用MANE Select转录本进行调用时，在其他结果旁给出MANE描述。
遗传咨询基于父母基因型而非任一变异的分类。父母双方均为携带致病性剪接供体变异单倍型的杂合携带者，因此每次未来妊娠的复发风险为25%。该数字不取决于先证者如何变为纯合：单亲二体（未检测）会改变其基因型的解释，但不会改变父母的携带状态。因两个变异位于顺式，产前或植入前检测可仅针对剪接变异，前提是此处建立的相位记录于家族档案中。
早期发病进行性先天性脊柱侧凸伴腕骨或跗骨联合的鉴别诊断包括FLNB、MYH3、RFLNA、GDF6和脊柱肋骨发育不良基因。靶向单基因检测无法有效解决此问题，影像学表型重叠足以使临床区分在腕骨联合显现前不可靠。外显子组对表型模拟基因的阴性结果支持但不单独证明FLNB特异性，因此PP4仅以支持强度应用，且仅应用于解释表型的变异。序列分析单独也会遗漏结构等位基因：多外显子FLNB缺失仅在2021年被认识为SCT病因，因此当在特征性表型儿童中发现单个致病性等位基因时，应跟进缺失和重复分析。
研究局限性包括：剪接变异后果为计算推断而非RNA分析确认；相位从先证者和父母的基因型推断而非在单个DNA分子上证明；单亲二体未正式检测；FLNB周围纯合片段从外显子组而非全基因组数据推导；堆积分析使用预测结构、单一缬氨酸旋转异构体且无弛豫；预测稳定性变化低于方法误差；两次弯度测量使用不同端椎；文献比较为描述性且受报告偏倚影响；四个早期报告无法在核苷酸水平与当前参考序列对账，按报告列出；Krakow等人家族的每患者计数取自系统综述而非原始报告。该研究涉及单个家族。
结论部分指出，先证者的临床和影像学表型为FLNB相关SCT的特征性表现，纯合经典剪接供体变异NM_001457.4:c.4514+1G>C解释该表型并基于预测证据分类为致病性。第二个FLNB变异c.6635C>T p.(Ala2212Val)亦为纯合；父母双方在两个位点均为杂合，因此两个变异位于同一祖先单倍型上，相距21,859 bp，由一级表亲父母双方传递。反式标准被考虑并排除，表型证据不能独立归属于错义变异，错义变异仍为意义未明；结构建模将Ala2212置于细丝蛋白重复21的埋藏核心，与轻度去稳定相容但不构成功能性证据。该病例记录了12个月内显著的脊柱侧凸进展、临床相关的颈椎受累及转录本特异性FLNB命名的重要性。其主要的可传递信息是，在近亲婚配家庭中，隐性基因内两个罕见变异的纯合反映单一单倍型，因此任一变异均不能独立获得等位基因或表型证据，而父母检测使该归属明确。
