益生菌黏附于Caco-2/HT-29共培养模型及SlpA与MUC2黏蛋白结构域相互作用的分子建模研究

《Agronomy》：Adhesion of Probiotic Bacteria to Caco-2/HT-29 Co-Culture and Molecular Modeling of SlpA Interactions with MUC2 Mucin Domains

　　

： 引言。 对肠道黏膜的黏附能力是益生菌筛选的关键标准。本研究采用短期Caco-2/HT-29共培养模型，该模型结合了肠上皮样细胞与HT-29细胞。该模型中黏蛋白的产生未经过实验验证。研究旨在评估各菌株在该模型中的黏附能力与细胞毒性，分析SlpA与MUC2结构域之间的相互作用，并评估在共培养体系中自动检测细胞核的可行性。 方法。 通过共聚焦显微镜观察共培养体系及细菌的形态。以未处理细胞对照组为基准，测定经细菌暴露的共培养体系的MTT还原活性，同时采用台盼蓝排斥试验评估细胞膜完整性。黏附能力在2小时后通过细胞计数及菌落形成单位（CFU）百分比进行评估。采用Faster R-CNN和YOLO11模型检测Caco-2/HT-29细胞核。通过分子对接、分子动力学及分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）计算分析SlpA与MUC2的D1和D3结构域的复合物。 结果。 单层完整性得以保持。两种细胞核检测模型表现出相当的性能（mAP@50 = 0.97；mAP 0.50–0.95分别为0.92和0.90）。相对MTT还原信号在暴露于动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）KB-54（81.05 ± 33.21%）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KATMIRA 1933（72.91 ± 31.26%）及解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-1895（59.47 ± 17.93%）后较高，而在暴露于动物双歧杆菌乳亚种KB-16（13.53 ± 9.44%）和嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）KB-41（7.35 ± 5.16%）后较低。细胞活力方面观察到相似的趋势。KATMIRA 1933表现出最高的黏附细胞数（12.72 ± 2.16）；在益生菌菌株中，KB-41和KB-16的数值较高。最高的黏附百分比见于KATMIRA 1933（5.32%）和KB-16（4.93%），而KB-54和KB-41的数值最低。在计算机模拟中，SlpA与去糖基化的MUC2 D1结构域形成的复合物表现出最有利的相互作用能（?10.63 ± 6.03 kJ/mol）。 结论。 短期Caco-2/HT-29共培养体系适用于在测试条件下联合评估细菌黏附、细胞代谢活性及膜完整性，同时细胞核可被自动定量。高黏附能力并非总是与细胞状态的维持相关，且SlpA-MUC2的相互作用依赖于糖基化状态。

论文解读

一、研究背景与科学问题

益生菌的筛选与评价是食品微生物学和肠道微生态研究的重要方向。在众多评价指标中，对肠道黏膜的黏附能力被认为是菌株筛选和后续功能表征的关键标准之一，因为黏附有助于细菌在肠上皮表面的短暂定殖，延长微生物与宿主细胞的相互作用时间，从而为益生功能在肠道内的发挥创造条件。然而，肠道黏膜是一个由肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞构成的异质性环境，其中肠上皮细胞和分泌黏液的杯状细胞是上皮的主要细胞组分。传统的细胞模型多采用Caco-2单层培养，该细胞系源于人结直肠癌，在融合后可形成具有肠上皮细胞样特性的极化单层，但在标准培养条件下几乎不产生具有生理意义的黏液。HT-29细胞同样源于结直肠癌，但在适当分化条件下可形成分泌黏蛋白的亚群。由于黏液层既能保护上皮，又能作为微生物与黏蛋白相互作用的基质，其存在与否及性质会显著影响细菌的黏附表型。因此，仅使用单一细胞类型的模型难以真实再现体内肠上皮的细胞组成和屏障组织结构。

现有研究表明，细菌对Caco-2细胞及不同黏蛋白含量体系的黏附存在显著差异，黏蛋白的加入以及HT29-MTX共培养的使用均会改变菌株的黏附水平，这提示黏液层在屏蔽顶端受体的同时，也为细菌结合提供了额外的表面。然而，目前尚缺乏在短期共培养体系中同时评估细菌黏附、细胞代谢活性、膜完整性以及分子层面黏附素-黏蛋白相互作用的整合性研究。此外，显微计数中细胞核的人工标注耗时且存在观察者间差异，自动化检测方法的适用性也需进一步验证。基于上述问题，本研究旨在建立基于短期Caco-2/HT-29共培养的肠上皮模型，综合评估益生菌的黏附特性及其对细胞状态的影响，并通过分子建模探讨SlpA与MUC2结构域相互作用的潜在机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员建立了Caco-2与HT-29细胞以9:1比例混合接种的短期共培养模型，在融合后72小时开展实验。研究采用共聚焦显微镜评估细胞形态及细菌空间分布，通过MTT还原试验和台盼蓝排斥试验分别评估细胞代谢活性和膜完整性，采用显微计数和CFU回收两种互补方法定量评估黏附能力，并利用Faster R-CNN和YOLO11两种目标检测架构进行细胞核自动检测的性能比较。在分子层面，研究人员以嗜酸乳杆菌NCFM的参考SlpA序列（UniProt P35829）与人MUC2的D1和D3结构域为对象，通过HADDOCK3.0进行从头对接，随后采用OpenMM进行50 ns分子动力学模拟，并结合MM/PBSA方法计算结合自由能。研究共构建了六种不同糖基化状态的复合物模型。

研究结果表明，短期Caco-2/HT-29共培养体系能够保持单层完整性，适用于细菌黏附、细胞代谢活性和膜完整性的联合评估。在细胞核检测方面，Faster R-CNN和YOLO11均表现出较高的检测性能，mAP@50均为0.97，mAP（0.50–0.95）分别为0.92和0.90，表明自动化细胞核计数在该模型中具有可行性。在菌株效应评估中，枯草芽孢杆菌KATMIRA 1933表现出最高的黏附细胞数和最高的黏附百分比，同时细胞状态指标相对保持良好；动物双歧杆菌乳亚种KB-16和嗜酸乳杆菌KB-41虽表现出较高的表面结合能力，但伴随显著的细胞活力下降；动物双歧杆菌乳亚种KB-54则表现为较低黏附但细胞代谢活性维持较好。分子建模结果显示，SlpA与去糖基化的MUC2 D1结构域复合物表现出最有利的相互作用能（?10.63 ± 6.03 kJ/mol），而糖基化状态和结构域类型显著影响相互作用能量，表明SlpA-MUC2相互作用依赖于糖基化程度。

三、关键技术方法

本研究采用了多项关键技术方法。细胞实验部分使用了Caco-2/HT-29共培养模型，细胞来源于俄罗斯顿河畔罗斯托夫国家医学研究中心肿瘤学细胞库。黏附评估采用Romanowsky-Giemsa染色后油镜显微计数和胰酶消化后平板涂布CFU计数两种方法。计算机视觉部分训练了Faster R-CNN（ResNet骨干）和YOLO11两种目标检测模型，数据集由38张荧光显微图像经数据增强扩展至434张。分子模拟部分采用HADDOCK3.0进行从头分子对接，OpenMM v8.6.1进行分子动力学模拟，AmberTools26进行结构准备，采用ff19SB蛋白力场、GLYCAM_06j-1糖力场和OPC水模型，并通过MM/PBSA方法计算结合自由能。

四、研究结果

4.1 共培养模型形态学评估与细菌可视化。 通过共聚焦激光扫描显微镜对暴露于枯草芽孢杆菌KATMIRA 1933后的共培养体系进行形态学观察，结果显示细胞层整体结构基本保持完整，细胞核经Sytox Green染色后呈现相对均匀的结构和清晰的轮廓，未观察到明显的核碎裂、凝缩或破坏迹象。在细胞表面区域可观察到单个杆状细菌细胞，证实了细菌与细胞之间存在空间接触。

4.2 计算机视觉模型在细胞核检测中的应用。 在训练过程中，Faster R-CNN在第6个epoch达到验证集mAP峰值后出现下降趋势，提示后期训练存在过拟合；YOLO11根据Ultralytics验证器的适应度标准在第13个epoch选择了最佳检查点。在测试集上，两种模型在四个评估指标上均表现优异，精确率和召回率均不低于0.95。但在细胞核密集排列的图像中，YOLO11检测到11个标注对象中的5个，而Faster R-CNN检测到9个，表明在密集场景下两阶段检测器具有更少的漏检。

4.3 共培养体系MTT还原及细胞膜完整性评估。 经24小时细菌暴露后，暴露于KB-54、KATMIRA 1933和B-1895的共培养体系表现出较高的背景校正后相对MTT还原信号，分别为81.05 ± 33.21%、72.91 ± 31.26%和59.47 ± 17.93%；而暴露于KB-16和KB-41的体系信号较低，分别为13.53 ± 9.44%和7.35 ± 5.16%。台盼蓝排斥试验显示，KATMIRA 1933和B-1895暴露后细胞活力最高（分别为73.2%和71.9%），KB-54居中（57.34%），KB-16和KB-41最低（分别为11.4%和4.50%）。所有细菌暴露组均显著低于未处理对照组（中位活力89.0%）。

4.4 黏附特性。 显微计数结果显示，对照菌株KATMIRA 1933的黏附细胞数最高（12.72 ± 2.16），益生菌菌株中KB-41（10.03 ± 2.00）和KB-16（9.83 ± 1.58）较高，B-1895（8.29 ± 2.22）和KB-54（7.28 ± 1.49）较低。统计分析表明KATMIRA 1933显著高于B-1895和KB-54，但与KB-16和KB-41的差异未达统计学显著水平。

4.5 黏附百分比。 基于CFU回收的黏附百分比结果显示，KATMIRA 1933的中位黏附百分比最高（5.32%），KB-16为4.93%，B-1895为3.25%，KB-54和KB-41分别为1.13%和1.10%。KATMIRA 1933显著高于KB-41和KB-54，KB-16和B-1895均显著高于KB-41和KB-54。

4.6 SlpA与MUC2黏蛋白结构域的分子建模。 分子动力学模拟显示各体系整体构象稳定，SlpA的RMSD未超过1.2 ?。MM/PBSA分析表明，去糖基化的天然MUC2 D1结构域与SlpA的复合物（MUC2D1_REF_NAKED）表现出最有利的相互作用能（?10.63 ± 6.03 kJ/mol），而两种D3结构域变体均表现出不利的相互作用能。残基贡献图谱识别了接触区域中对稳定化作用贡献显著的氨基酸位点。

五、讨论与结论

讨论部分指出，短期Caco-2/HT-29共培养体系可被视为一个整合性实验系统，能够同时评估菌株与上皮-黏膜表面的相互作用能力、对细胞代谢活性和活力的影响，以及细菌表面蛋白与MUC2黏蛋白结构域相互作用的潜在机制。研究强调，黏附能力本身不足以作为益生菌筛选的唯一标准，必须与上皮安全性及黏液层内的滞留机制综合考虑。研究还指出，显微计数和CFU回收方法分别反映细菌表面结合的不同方面，前者表征形态学上可检测的总结合菌群，后者反映洗涤后仍可培养的活菌部分，两种方法的差异互补性地扩展了菌株比较的信息维度。分子建模结果被定位为假设生成性分析，而非菌株特异性黏附差异的直接机制解释，因为参考SlpA序列并未在实验菌株中得到验证，且芽孢杆菌的表面组织与乳杆菌S层不同。

研究结论认为，枯草芽孢杆菌KATMIRA 1933兼具最高平均显微结合量和最高中位培养法黏附百分比，同时共培养体系状态指标相对保持良好。KB-16和KB-41虽表现出较高的表面结合，但其较低的台盼蓝排斥值和MTT还原值表明强细菌结合并不一定伴随有利的细胞反应。KB-54则表现为较低黏附但细胞状态相关指标维持较好。Faster R-CNN和YOLO11在内部测试图像中均实现了较高的Caco-2/HT-29细胞核检测性能，支持自动化对象计数的可行性。分子建模结果表明，参考嗜酸乳杆菌SlpA与MUC2的相互作用可能同时依赖于黏蛋白结构域类型及其糖基化状态，去糖基化D1结构域相对有利的相互作用预测凸显了局部表面可及性的潜在重要性，为后续实验验证提供了聚焦的机制性假设。