基于系统发育验证的木栖真菌酪氨酸酶抑制活性的比较评价

《Mycobiology》：Comparative Evaluation of Tyrosinase Inhibitory Activity in Taxonomically Verified Wood-Inhabiting Fungi

　　

摘要：木栖真菌（wood-inhabiting fungi）是一个分类学上和代谢上都高度多样化的类群，具有作为生物活性化合物来源的潜力，然而除了少数知名的药用物种外，其酪氨酸酶（tyrosinase）抑制活性仍鲜有探索。在本研究中，研究人员对来自锈革孔菌目（Hymenochaetales）和多孔菌目（Polyporales）的49株经系统发育验证的木栖真菌的培养菌丝体提取物，进行了酪氨酸酶抑制活性的比较评价。菌株在标准化条件下培养，从三个独立生物学重复中制备乙醇提取物，并在0.1、0.5、1和5 mg/mL浓度下进行评估。测试菌株间的酪氨酸酶抑制活性差异显著，且总体上随提取物浓度增加而升高。Hydnophlebia alachuana 和 Nigroporus vinosus 显示出特别高的活性，包括在最低测试浓度下的显著抑制作用。这些发现扩大了被评估具有酪氨酸酶抑制作用的木栖真菌的范围，并确定了先前未被充分研究的分类单元作为进一步研究的有前景候选者。研究结果为优先筛选活性真菌菌株进行化学表征及其酪氨酸酶抑制潜力的进一步评估提供了基础。

研究背景与科学问题

黑色素在保护皮肤免受紫外线辐射方面发挥重要作用，但其过量产生会导致黄褐斑等色素沉着过度疾病。酪氨酸酶（tyrosinase）是黑色素生物合成中的关键酶，催化L-酪氨酸转化为L-DOPA并进一步氧化为多巴醌，从而启动黑色素的形成。因此，酪氨酸酶抑制剂作为调控黑色素生成的化妆品和皮肤病学制剂被广泛研究。由于一些合成抑制剂存在安全性和稳定性方面的顾虑，人们对天然来源替代品的兴趣日益增加。真菌因其能够产生多种多样的生物活性代谢产物，包括酚类、萜类、多糖以及其他具有抗氧化和酶抑制活性的次级代谢产物，而被视为此类化合物的有前景来源。

在真菌中，木栖真菌（wood-inhabiting fungi）是一个分类学和代谢多样性极高的类群，但其作为酪氨酸酶抑制剂来源的研究相对不足。这些真菌通过分解木质纤维素材料在森林生态系统中扮演重要角色，包括具有不同木材腐朽策略的白腐菌和褐腐菌。它们的复杂代谢与其产生多种酶和次级代谢产物相关，其中一些已被报道具有抗氧化、抗菌、抗炎及其他生物活性。尽管已在若干木栖真菌中报道了酪氨酸酶抑制活性，但以往的研究通常集中于少数已知物种，使得更广泛的木栖真菌多样性在该活性方面很大程度上未被探索。

准确的分类鉴定在真菌生物活性的比较筛选中尤为重要。许多木栖真菌属于物种复合群或包含形态相似的分类单元，仅依靠形态学难以可靠区分。错误鉴定或模糊的物种界定可能会掩盖与分类单元相关的代谢产物差异，并限制功能研究的可重复性。此外，以往许多关于真菌酪氨酸酶抑制的研究使用了子实体提取物，其可用性受季节和环境条件限制。培养菌丝体则提供了一种替代的真菌生物量来源，可在受控条件下持续生产，因此适用于比较生物活性筛选及后续的代谢产物生产。将系统发育验证的菌株与标准化的菌丝体培养相结合，为评估不同木栖真菌的生物活性提供了一个可重复的框架。

研究内容与主要结论

本研究对49株属于锈革孔菌目（Hymenochaetales）和多孔菌目（Polyporales）的系统发育验证的木栖真菌菌株的培养菌丝体提取物，进行了酪氨酸酶抑制活性的比较评价。研究旨在通过标准化的培养和提取条件，筛选分类学上广泛的木栖真菌菌株，刻画其酪氨酸酶抑制活性的变异特征，并识别出此前被忽视的具有高抑制潜力的分类单元。研究发现，测试菌株间的酪氨酸酶抑制活性差异显著，且总体上随提取物浓度增加而升高。Nigroporus vinosus 和 Hydnophlebia alachuana 表现出特别高的活性，即使在最低测试浓度下也显示出显著抑制，其中 N. vinosus 的抑制率超过了阳性对照熊果苷（arbutin）。这些发现扩大了被评估具有酪氨酸酶抑制作用的木栖真菌范围，并为优先筛选活性菌株进行进一步的化学和功能性表征提供了依据。

关键技术方法

1. 1.
   真菌菌株与分类鉴定：研究使用了来自韩国多个森林采集的子实体分离的49株木栖真菌菌株，保存于首尔大学真菌保藏中心（SFC）或韩国蘑菇资源库（KMRB）。通过提取基因组DNA，扩增和测序内转录间隔区（ITS）和核大亚基核糖体DNA（nLSU）序列，并结合从GenBank检索的参考序列进行最大似然法（maximum-likelihood）系统发育分析，以验证菌株的分类学身份。
2. 2.
   菌丝体培养与提取：在标准化条件下，将菌株在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中于25°C、150 rpm摇瓶培养14天。收获菌丝体后冷冻干燥并研磨成粉末，使用75%乙醇按1:20（w/v）比例室温提取48小时，离心取上清液冻干获得粗提物。
3. 3.
   酪氨酸酶抑制活性测定：采用蘑菇酪氨酸酶（mushroom tyrosinase）和L-酪氨酸为底物的96孔微板法，在0.1、0.5、1和5 mg/mL四个最终浓度下评估提取物的抑制活性。通过在280 nm处测量吸光度监测反应，并使用相应的提取物空白校正背景吸收，计算抑制百分率。
4. 4.
   统计分析：采用双因素重复测量方差分析（two-way repeated-measures ANOVA），以真菌菌株为被试间因素，提取物浓度为被试内因素，评估两者对酪氨酸酶抑制活性的影响及其交互作用，显著性水平设定为p < 0.05。

研究结果

3.1 真菌菌株的分类学验证

共49株分属于锈革孔菌目（Hymenochaetales）和多孔菌目（Polyporales）中20个科的木栖真菌被纳入研究。基于ITS和nLSU串联序列的系统发育分析支持了所有菌株的分类学鉴定。

3.2 菌丝体提取物的酪氨酸酶抑制活性

测试菌株间的酪氨酸酶抑制活性差异显著，且总体上随提取物浓度增加而升高。

• •
  在最低浓度（0.1 mg/mL）下，多数菌株显示较低至中等抑制，而 Nigroporus vinosus 表现出最高抑制率（81.6%），超过阳性对照熊果苷（74.0%），其次为 Hydnophlebia alachuana（71.6%）。
• •
  在0.5和1 mg/mL浓度下，大多数菌株的抑制活性增加。在1 mg/mL时，N. vinosus 显示出最高抑制（>95%），其次是 Bjerkandera adusta 菌株1、H. alachuana 和 Laetiporus cremeiporus 菌株1，均超过80%。
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  在5 mg/mL浓度下，多数菌株的抑制活性进一步增强，N. vinosus 维持最高活性（约98%）。若干锈革孔菌目菌株，如 Cyanotrama gypsea、Inonotus obliquus、Phellinus igniarius 和 Sanghuangporus vaninii，在此浓度下也表现出超过80%的抑制。
• •
  同种不同菌株间也存在活性差异，例如两株 B. adusta 和 L. cremeiporus 在不同浓度下显示了不同的抑制水平。
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  从系统发育关系看，平伏菌科（Steccherinaceae）、焦孔菌科（Adustoporiaceae）和灵芝科（Ganodermataceae）包含相对活跃的分类单元，而所检测的迷孔菌科（Fomitopsidaceae）活性普遍较低。皱孔菌科（Irpicaceae）和锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）及多孔菌科（Polyporaceae）则涵盖了从低到高的活性范围。

3.3 酪氨酸酶抑制的统计分析

双因素重复测量方差分析结果显示，真菌菌株（F_48,98 = 14,781, p < 0.001）、提取物浓度（F_3,294 = 235,520, p < 0.001）以及两者的交互作用（F_144,294 = 1,071, p < 0.001）均对酪氨酸酶抑制活性有显著影响。显著的交互作用表明，浓度依赖性变化的幅度在不同真菌菌株之间存在差异。

讨论与结论总结

本研究采用分类学验证的真菌培养物和标准化的菌丝体培养方法，实现了对不同木栖真菌酪氨酸酶抑制活性的比较筛选。系统发育验证为将观察到的活性与单个真菌菌株关联提供了可靠的分类学基础，而标准化的培养和提取则允许在一致的实验条件下评估其抑制活性。比较筛选揭示了木栖真菌培养菌丝体提取物中酪氨酸酶抑制活性的巨大差异。Hydnophlebia alachuana 和 Nigroporus vinosus 尤为引人注目，因为它们在最低测试浓度下就显示出显著的抑制活性，且 N. vinosus 的抑制百分比高于熊果苷。这两个物种作为生物活性代谢产物的来源此前很少受到关注，因此它们的高活性尤其值得注意。本研究将发现扩展到常见的食用和药用真菌之外，证明在更广泛的木栖真菌多样性中存在显著的活性差异。

研究结论指出，H. alachuana 和 N. vinosus 是最具前景的候选菌株，应优先对其进行活性化合物的鉴定，并使用人源酪氨酸酶和基于细胞的黑色素生成模型验证其活性。同时，对更多有前景分类单元的菌株进行筛选将有助于评估种内变异。总体而言，本研究扩大了被评估具有酪氨酸酶抑制作用的木栖真菌范围，并为优先筛选此前未被充分探索的真菌菌株进行进一步的化学和功能性表征提供了基础。