基于PfMSP2的自扩增RNA疫苗诱导针对血液期恶性疟原虫功能性抗体的剂量节约潜力评估

《Vaccines》：Evaluating a Potential Dose-Sparing Self-Amplifying RNA Vaccine for Induction of Functional Antibodies to Blood-Stage Plasmodium falciparum Malaria

　　

评估一种潜在剂量节约型自扩增RNA疫苗诱导针对血液期恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）功能性抗体的效果
引言：迫切需要新一代疟疾疫苗以提供更高的效力和持久性。靶向血液期裂殖子（merozoites）的抗体可通过多种Fc介导功能赋予针对临床疟疾的保护。特别是，裂殖子表面蛋白2（PfMSP2）是已知的保护性抗体靶点，可通过多种抗体Fc介导功能清除裂殖子，使其成为极具前景的疫苗候选抗原。方法：研究人员将PfMSP2开发为自扩增RNA（saRNA）疫苗，并在哺乳动物细胞中成功验证了其体外表达。随后，将PfMSP2-saRNA配制为脂质纳米颗粒（LNPs），并在小鼠中采用三剂方案比较1 μg和10 μg剂量评估其免疫原性。研究人员评估了具有与保护性免疫相关功能活性的抗体的诱导情况。结果：PfMSP2-saRNA疫苗诱导了抗原特异性IgG应答，可识别完整裂殖子表面。1 μg和10 μg给药方案均诱导了针对PfMSP2的相当水平抗体，且应答以小鼠细胞亲和性IgG亚类为主。这些疫苗诱导的抗体在仅两剂后即表现出强效Fc介导功能，包括补体固定和人Fcγ受体I（FcγRI）结合，并在第三剂后保持一致。结论：PfMSP2在saRNA疫苗平台上具有高度免疫原性，在潜在剂量节约方案中可诱导具有多种与人类保护性免疫相关Fc介导功能的抗体。该saRNA平台是开发需要较低剂量和较少剂次的高效疫苗的有前景策略。

研究背景：疟疾在全球范围内造成严重健康负担，2024年记录病例超过2.5亿例、死亡约60万例，非洲地区和幼儿群体负担最重。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）引起大多数疾病病例，且未来数年存在复发风险，因此需要有效疫苗用于疟疾控制和消除。恶性疟原虫生命周期复杂，按蚊通过皮肤叮咬传播子孢子（sporozoites），子孢子感染肝细胞并发育为裂殖子，随后释放入血并在红细胞内进行指数性无性繁殖，导致临床疟疾并可能引起重症和死亡。目前仅有两种获批疟疾疫苗RTS,S/AS01和R21/Matrix-M，均靶向子孢子以预防初始肝脏感染，但效力有限，突破性血液期寄生虫血症和临床疟疾仍会发生，且需要每年加强接种。因此需要具有更高效力和持久性的新一代疫苗。血液期裂殖子抗原是有吸引力的疫苗靶点，因其有潜力减少血液期复制和临床疾病。靶向裂殖子的抗体可通过Fc介导的抗体功能抑制血液期复制，包括补体固定和与Fc受体相互作用以促进调理吞噬作用和细胞毒性。PfMSP2是一种丰富的表面蛋白，是抗血液期疟疾的潜在疫苗候选抗原，具有由两个等位基因家族（3D7和FC27）组成的可变二态区域以及保守的N端和C端结构域。自然获得的抗PfMSP2抗体在不同人群中与疟疾保护相关。抗体通过Fc区域介导补体固定和调理吞噬作用，从而抑制血液期复制，因此诱导这些保护性抗体功能对未来血液期疫苗至关重要。疫苗技术进步和SARS-CoV-2 mRNA疫苗的成功开启了传染病快速疫苗开发的新时代。mRNA技术提供高效的单抗原和多抗原制剂，可快速适应新发病原体，且相对较小剂量即可对多种传染病产生足够免疫原性。传统mRNA-脂质纳米颗粒（LNP）平台已在恶性疟原虫和间日疟原虫（P. vivax）的肝脏期和传播期进行评估，显示该平台用于疟疾疫苗开发的可行性。尽管mRNA-LNP疫苗可诱导强健抗体应答，但传统非复制线性mRNA存在局限性，包括可能需要高剂量、多剂方案以及mRNA内体逃逸用于翻译的效率低下。为克服这些局限，可利用下一代自扩增RNA（saRNA）平台。saRNA载体包含由甲病毒衍生的四种非结构蛋白（nsP1-4）组成的病毒复制酶复合体，可在原位实现RNA转录本的自限性复制。该复合体将正 sense RNA（+ssRNA）复制为负 sense RNA（-ssRNA），再回到+ssRNA进行翻译。委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）复制子是最广泛使用的甲病毒衍生saRNA平台之一，但其他甲病毒的复制子也可利用。这种复制特性提供潜在优势，如较低（和较少）剂量即可延长抗原表达以产生强健免疫应答和抗体持久性。重要的是，尚未有saRNA疫苗与感染性病毒之间可能产生新功能性嵌合病毒的重组报道。近期一种SARS-CoV-2 saRNA疫苗在日本获批，尽管剂量低6–20倍，但与传统mRNA疫苗相比显示出持久免疫应答。此外，狂犬病糖蛋白saRNA疫苗在临床前模型和I期临床试验中显示出前景，以超低且较少剂次的saRNA引发超过WHO定义保护基准的免疫应答。这些发现表明saRNA平台可能是目前获批的全灭活狂犬病病毒疫苗的有效替代品。这一有前景的疫苗平台也已在其他传染病如季节性流感、呼吸道合胞病毒（RSV）和B群脑膜炎奈瑟菌（MenB）中评估，但尚未作为疟疾疫苗进行评估。在此，研究人员设计并评估了使用saRNA-LNP平台两种给药方案的PfMSP2疫苗，旨在产生针对裂殖子的功能性抗体。这项工作为潜在的剂量节约和更短疗程新一代疟疾saRNA疫苗提供了重要概念验证。

研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员将PfMSP2（3D7等位基因）开发为saRNA疫苗，先在Expi293F（HEK293）悬浮细胞中验证抗原表达，随后配制为LNP并在雌性C57BL/6小鼠中比较低剂量（3 × 1 μg）和高剂量（3 × 10 μg）方案。结果显示，两种剂量方案在第二剂后即诱导相当水平的抗原特异性IgG，第三剂后无显著增加；疫苗诱导的IgG可识别完整裂殖子表面；IgG亚类以细胞亲和性IgG2b和IgG2c为主；疫苗诱导抗体在仅两剂后即表现出强效补体C1q固定和人FcγRI结合功能，第三剂后保持可比。研究表明PfMSP2在saRNA平台上具有高度免疫原性，1 μg两剂方案即可诱导功能性IgG，具有剂量节约潜力。该研究为saRNA-LNP作为疟疾疫苗平台提供了概念验证，支持未来评估其他抗原包括多抗原设计，并提示该平台可提供短疗程、低剂量的保护性疫苗效力。

主要关键技术方法：研究采用甲病毒衍生saRNA-2载体（含5′ Cap1、3′ Poly(A)和5-甲基胞苷替换）编码密码子优化的PfMSP2 3D7序列（Δ19N、Δ23C，C端Flag标签），配制为SM-102 LNP制剂；通过Expi293F细胞转染和Western blot验证体外表达；使用雌性C57BL/6小鼠（8–12周龄，每组n = 5）进行三种剂量肌内注射免疫（第0、28、56天）；通过ELISA检测总IgG、IgG亚类、完整裂殖子结合、人C1q固定和人FcγRI结合；采用GraphPad Prism 11进行非参数Mann–Whitney检验、Wilcoxon检验和Spearman相关性分析。本研究中未设空LNP或无关saRNA对照组，样本量基于概念验证研究考虑。

研究结果：
3.1 PfMSP2 saRNA疫苗在小鼠中显示高免疫原性：研究人员设计了近全长PfMSP2（3D7等位基因）saRNA疫苗，通过Expi293F细胞转染和Western blot检测C端Flag标签，确认PfMSP2在预期分子量处随时间表达。随后在雌性C57BL/6小鼠中比较3 × 1 μg和3 × 10 μg方案。疫苗诱导的IgG在第二剂后两组均升高，但第三剂后无显著增加。与重组蛋白和mRNA疫苗平台比较，saRNA两种方案在第二和第三剂后表现 broadly 增强且生物学变异更低，提示saRNA-LNP疫苗可能具有以较少剂次实现最大IgG诱导的剂量节约优势。用血液期培养分离的完整裂殖子进行ELISA，高剂量10 μg方案在峰值（第70天）诱导的IgG可识别裂殖子表面，与重组蛋白或mRNA疫苗对照无显著差异，但saRNA组小鼠间变异更小。
3.2 PfMSP2 saRNA疫苗诱导具有Fc介导活性的高功能性IgG：研究人员检测小鼠IgG亚类谱，发现赋予Fc介导保护功能的细胞亲和性小鼠IgG2b和IgG2c被强烈诱导，两种方案亚类谱相当，IgG2b和IgG2c水平较高而IgG1和IgG3较低；第三剂后亚类水平仅中度增加，与总IgG结果一致。研究人员进一步用体外替代试验检测Fc介导功能，发现小鼠IgG表现出强C1q固定（经典补体激活第一步）和强FcγRI结合。两组功能活性 broadly 相当，10 μg方案在第二剂后显示显著更高活性，但未比1 μg方案高10倍；第三剂后两组功能无显著差异，表明saRNA疫苗具有诱导功能性IgG亚类的剂量节约潜力。探索性分析发现Fc介导功能活性（C1q固定和FcγRI结合）与IgG2c相关性最强，与其他IgG亚类中度相关。

讨论部分总结：研究人员展示了利用saRNA疫苗技术靶向恶性疟原虫裂殖子表面以产生具有Fc介导功能活性抗体的新策略。PfMSP2是丰富的裂殖子表面抗原，是saRNA疫苗的理想靶点，且已被证明是促进补体固定、导致裂殖子复制抑制和调理吞噬的功能性抗体靶点，其抗体在自然获得性和疫苗诱导免疫研究中与保护相关。本研究中疫苗结果显示出使用1 μg两剂剂量节约方案即可产生具有Fc介导功能活性的有效抗体。PfMSP2作为saRNA-LNP疟疾疫苗的良好概念验证，支持未来评估其他抗原包括多抗原疫苗设计。研究人员在将saRNA疫苗推进至动物研究前验证了PfMSP2在哺乳动物细胞中的表达。saRNA-LNP制剂在1 μg或10 μg方案两剂后即诱导最佳水平的细胞亲和性IgG亚类，不同于需要三剂的传统mRNA疫苗。传统mRNA疫苗体内翻译效率据报道为1–2%，归因于内体逃逸限制，因此需要更高和重复mRNA剂量；相比之下，saRNA在原位自我复制，允许较低剂量下延长和增加抗原呈递，从而降低低内体逃逸的影响。值得注意的是，saRNA疫苗在两种剂量方案（1 μg和10 μg）间免疫原性相当，且与重组蛋白和传统mRNA疫苗相比小鼠间生物学变异更小。使用更高或额外剂量saRNA未显示免疫原性改善，证明多种传染病中报道的潜在剂量节约优势。然而，需要进一步使用更低saRNA量、更大样本量和对照组的剂量优化研究来进一步证明平台优势并正式评估不同给药方案和增加统计效力。saRNA疫苗诱导抗体显示出与功能性介质即补体固定和FcγRI相互作用的强IgG Fc介导结合。saRNA疫苗诱导抗体的功能谱与先前报道的重组PfMSP2蛋白疫苗临床试验和自然获得性免疫抗体以及传统PfMSP2 mRNA疫苗临床前研究相似。Fcγ受体结合和补体固定功能已被证明是体外和体内抑制和清除寄生虫的关键。在C57BL/6小鼠中，IgG2b和IgG2c亚类可有效介导抗体功能，且几乎 exclusively 由saRNA平台诱导，表明saRNA疫苗接种后优先诱导功能性IgG亚类的优势，可能增强疫苗诱导免疫应答。自然获得性抗体据报道靶向PfMSP2可变等位基因特异性区域，而疫苗诱导抗体显示更多靶向保守表位。未来研究需要进一步构建优化和纳入FC27等位基因。此外，检查细胞免疫动力学可能提供疫苗持久性见解，包括刺激支持抗体生成的CD4+滤泡辅助性T细胞和B细胞记忆群体扩增。进一步研究还可通过比较传统mRNA和saRNA疫苗及不同剂量评估抗体亲和力。动物模型可用于评估疫苗保护效力，但已建立的小鼠模型进行这些分析存在局限。因此，未来研究探索人源化小鼠和人类类器官模型分析疫苗应答将有价值。此外，由于啮齿类疟疾物种中缺乏PfMSP2或直系同源物，以及人类和小鼠C1q和Fc介导功能的差异，实验室小鼠模型对评估PfMSP2基础疫苗效力构成局限。未来研究中，该saRNA疫苗可在非人灵长类模型或控制性人类疟疾感染（CHMI）疫苗试验中进一步评估。

研究结论翻译：本研究为使用saRNA-LNP作为疟疾疫苗平台提供了概念验证，证明其强免疫原性和抗体功能活性。研究人员表明PfMSP2 saRNA-LNP疫苗可用于1 μg的剂量节约和较少剂次方案诱导功能性IgG。低剂量和两剂诱导的高IgG与10 μg方案 broadly 相当。该平台可扩展至包括其他在研疟疾疫苗抗原如PfRh5，以诱导具有生长抑制和Fc介导功能活性的抗体。该平台可提供短疗程和低剂量疫苗方案的保护性疫苗效力。