三种重组布鲁氏菌疫苗制剂（BruVac-Pro、BruVac-CPX和BruVac-FLU）在小鼠羊种布鲁氏菌攻毒模型中的临床前比较评价

《Vaccines》：Comparative Preclinical Evaluation of Three Recombinant Brucella Vaccine Formulations, BruVac-Pro, BruVac-CPX and BruVac-FLU, in a Murine Brucella melitensis Challenge Model

　　

背景/目的：布鲁氏菌病仍然是一种广泛存在的人畜共患病，但目前尚无获批的人类疫苗，且用于动物的减毒活疫苗因残留毒力和意外感染风险而不适用于人类。重组平台是有吸引力的替代方案，但在单一研究中进行直接的头对头比较仍很罕见。本研究比较了三种重组候选疫苗的安全性、免疫原性和保护效力：AddaS03佐剂亚单位疫苗BruVac-Pro、羊痘病毒载体疫苗BruVac-CPX和流感病毒载体疫苗BruVac-FLU。方法：近交系BALB/c小鼠（n=355）接受了初免-加强免疫，单次给药的Rev-1参考组除外。每组10只动物构成一个亚组，从第0天开始进行血清学监测，随后腹腔注射强毒羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）16M进行攻毒，其余动物被分配到安全性、载体检测和细胞免疫读数实验组。研究人员无法记录分配至攻毒队列的时间安排和前瞻性性质；因此不能排除疗效终点中的选择偏倚。安全性通过临床观察、体重和早期血清临床化学进行评估；通过间接ELISA测量针对Omp16、Omp19、L7/L12和SodC的抗原特异性IgG；保护效力通过脾脏细菌载量（Y）、保护指数（PI）和无脾脏细菌回收的动物比例（每组n=10）进行量化。免疫原性仅评估为体液免疫（IgG）反应；抗原特异性细胞反应在同一实验的单独亚组中进行了测量，并将另行报告。结果：免疫期间的死亡率仅限于三个舌下给药的病毒载体和稳定剂组（CPX/CPX 4/50，CCFLU/CCFLU 3/55，FLU/FLU 1/55），而Pro/Pro、AddaS03/AddaS03、Rev-1或PBS/PBS组无死亡（8/160对比0/195）；存活动物未显示明显的临床症状。在未确定灵敏度的定性检测中，第3天和第6天在血清或脾脏中均未检测到流感载体RNA。针对Omp16和Omp19的血清学转换仅限于含有Pro的组；没有任何组的动物对SodC发生血清学转换，而对L7/L12的反应仅限于孤立的单个动物，无组别模式。各组间的脾脏载菌量存在差异（Kruskal-Wallis检验，p=4×10-7）。BruVac-Pro提供了最强的保护（Y 2.32；PI 2.62；70.0%无细菌回收；与磷酸盐缓冲液（PBS）对照组相比，脾脏载菌量的p=0.028，无细菌回收动物比例的校正后p=0.015）。BruVac-CPX仅显示出非显著的载菌量降低趋势（PI 1.54；多重比较校正后p=0.57），且未提高清除率（20.0%），而BruVac-FLU未能阻止定植。Rev-1证实了模型的有效性（PI 3.15；80.0%）。结论：在所测试的非等效、特定制剂的方案下，BruVac-Pro是唯一无死亡率和明显临床症状的实验性制剂，产生了最一致的抗原特异性IgG反应，并且是唯一相对于PBS和佐剂对照显著降低第14天脾脏载菌量的实验性候选疫苗。这些发现支持对该制剂进行进一步的剂量、机制和持久性研究，但不能确立平台优越性、无菌免疫或适用于人类。

研究背景与目的

布鲁氏菌病（Brucellosis）是一种由胞内寄生的布鲁氏菌属（Brucella spp.）引起的重要人畜共患病，对人类健康、畜牧业生产和农村经济造成重大负担。其中，羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）因其对人类的高传染性和引发严重全身性疾病的能力而尤为关键。目前，虽然有针对动物的减毒活疫苗，如Rev-1，但这些疫苗因存在残余毒力、可能导致流产以及意外感染人类的风险，不适用于人类。因此，开发基于明确抗原和非活体递送平台的更安全的重组疫苗至关重要。尽管已有大量关于实验性布鲁氏菌疫苗的研究，但由于不同研究在动物品系、抗原剂量、佐剂、免疫程序、攻毒菌株和保护效力定义等方面存在巨大异质性，很难直接比较不同技术平台之间的优劣。为此，本研究旨在同一受控实验中，对三种代表不同技术类别（佐剂纯化蛋白亚单位疫苗、DNA病毒载体疫苗、RNA病毒载体疫苗）的实验性重组候选疫苗——BruVac-Pro、BruVac-CPX和BruVac-FLU——进行头对头的安全性、免疫原性和保护效力比较，以筛选出最有希望进入后续临床前开发的候选疫苗。

研究方法与技术

本研究是一项在哈萨克斯坦RIBSP机构进行的受控临床前研究（方案号LKB-B-02）。研究人员使用了355只近交系BALB/c小鼠，分为7个组，分别接受不同的免疫方案。关键技术方法包括：

1. 1.
   免疫与攻毒模型：采用初免-加强免疫策略（Rev-1组为单次免疫），随后在第42天通过腹腔注射强毒羊种布鲁氏菌16M进行攻毒，并在攻毒后第14天处死动物进行保护效力评估。攻毒模型有效性依据世界动物卫生组织（WOAH）标准进行验证。
2. 2.
   安全性评估：通过每日临床观察、体重动态变化（使用重复测量方差分析）以及早期（第3天）血清临床生化指标（使用单因素方差分析和Tukey事后检验）进行评估。
3. 3.
   体液免疫应答评估：采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中针对四种重组抗原（Omp16、Omp19、SodC、L7/L12）的特异性IgG抗体水平，并以样品与阳性对照比值（S/P%）≥40%作为阳性阈值。
4. 4.
   保护效力评估：主要终点为脾脏细菌载量（以log₁₀形式表示，记为Y值）、由此计算出的保护指数（PI），以及无脾脏可检出细菌定植的动物比例。数据采用非参数Kruskal-Wallis检验及Dunn事后多重比较进行分析。
5. 5.
   载体生物分布检测：对于流感病毒载体疫苗BruVac-FLU，采用一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测其在血清和脾脏中的RNA。

研究结果

3.1 临床观察与体重动态

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  结果：所有存活至指定终点的动物一般状况良好。然而，死亡率分布不均。共有8只动物在免疫期间死亡，全部发生在接受舌下给药的病毒载体或稳定剂组（CPX/CPX组4只、CCFLU/CCFLU组3只、FLU/FLU组1只），而Pro/Pro、AddaS03/AddaS03、Rev-1和PBS/PBS组无死亡。由于PBS/PBS对照组也通过舌下给药却无死亡，且不含抗原的CCFLU/CCFLU组也出现死亡，研究人员认为死亡率更可能与病毒载体配方及其稳定介质有关，而非给药途径或重组抗原本身。
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  结论：BruVac-Pro是唯一在评估条件下未观察到死亡率和明显临床毒性的实验性制剂。

3.2 流感载体遗传物质检测

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  结果：在免疫后第3天和第6天，所有BruVac-FLU免疫动物的血清和脾脏样本中，均未通过RT-PCR检测到流感载体RNA的特异性条带。
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  结论：在所用检测方法的条件下，未在血清和脾脏中检测到流感载体RNA。

3.3 抗原特异性体液免疫应答

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  结果：血清学转换主要局限于Pro/Pro组，且针对的是外膜蛋白Omp16和Omp19。Pro/Pro组在加强免疫后对所有这两种抗原均实现了100%的血清学转换。在所有组中，没有动物达到针对SodC的阳性阈值。针对L7/L12的反应仅限于孤立的个别动物，无组别模式。
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  结论：BruVac-Pro制剂诱导了最强和最一致的针对Omp16和Omp19的抗体反应。

3.4 血清临床化学

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  结果：在第3天的早期生化面板中，所有组的平均参数值均在参考区间内。仅丙氨酸氨基转移酶（ALT）在各组间存在统计学差异，但趋势是疫苗组低于对照组，这与肝细胞损伤的方向相反。后期的生化面板因分析运行失败而被整体撤回。
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  结论：早期生化指标未提示任何疫苗制剂存在病理学改变。

3.5 尸检、器官指数与肉眼所见

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  结果：攻毒后第14天，在未保护的对照组中观察到明显的脾肿大。Pro/Pro和Rev-1组的脾脏指数最低，与低脾脏载菌量一致。值得注意的是，FLU/FLU组的脾肿大程度有限，但这并未与其高脾脏载菌量相对应。
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  结论：器官数据是描述性的，不应作为独立的保护效力衡量指标。

3.6 攻毒后的保护效力

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  结果：攻毒模型有效（PBS对照组Y=4.94，Rev-1组PI=3.15）。各组间脾脏载菌量存在极显著差异（Kruskal-Wallis，p=4×10^-7）。BruVac-Pro提供了最强的保护（Y=2.32，PI=2.62，70%动物无脾脏细菌回收），其载菌量降低相对于PBS和佐剂对照均有统计学意义。BruVac-CPX显示出非显著的载菌量降低趋势（PI=1.54，校正后p=0.57）。BruVac-FLU未能提供保护。
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  结论：BruVac-Pro是唯一在统计学上显著降低脾脏载菌量的实验性候选疫苗。

讨论与结论

研究人员指出，这是少数在同一实验中直接比较不同重组布鲁氏菌疫苗平台的研究之一，是其主要的优势所在。在耐受性方面，BruVac-Pro表现最佳，而病毒载体疫苗相关的死亡率需要进一步调查。在免疫原性方面，BruVac-Pro诱导了最强的针对Omp16和Omp19的抗体反应，而SodC和L7/L12的体液免疫原性较弱，这符合它们更倾向于诱导体液免疫而非细胞免疫的特点。在保护效力方面，BruVac-Pro达到了约2.62 log₁₀的载菌量减少，处于非活体布鲁氏菌疫苗报道范围的上限，而两种病毒载体疫苗的效果不佳。

研究结论：在所测试的非等效、特定制剂的方案下，BruVac-Pro是唯一无死亡率和明显临床症状的实验性制剂，产生了最一致的抗原特异性IgG反应，并且是唯一相对于PBS和佐剂对照显著降低攻毒后第14天脾脏载菌量的实验性候选疫苗。这些发现支持对该制剂进行进一步的剂量、机制和持久性研究，但不能据此确立平台优越性、证明其能达到无菌免疫或表明其适用于人类。