《iScience》：Extending digital biology: Bacterial survival and morphological heterogeneity under antibiotic stress
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细菌形态会因抗生素胁迫而发生改变，其变化取决于抗生素的作用机制，而形态变化又可促进细胞存活。本研究提出了一套工作流程，可针对168种抗生素条件下单个细菌细胞的后代生成形态学特征谱。该流程利用静止微流控液滴封装并培养细菌，结合共聚焦显微镜对液滴内容物进行成像；通
细菌形态会因抗生素胁迫而发生改变，其变化取决于抗生素的作用机制，而形态变化又可促进细胞存活。本研究提出了一套工作流程，可针对168种抗生素条件下单个细菌细胞的后代生成形态学特征谱。该流程利用静止微流控液滴封装并培养细菌，结合共聚焦显微镜对液滴内容物进行成像；通过定制图像分析流程对部分图像中的形态进行标注以训练神经网络；该网络从82,000个液滴中提取多维形态学特征谱，结果表明即使是个体细胞的后代之间也存在不同形态的共存现象。这些特征谱随抗生素种类和浓度而异，为按作用机制区分抗生素提供了途径。结合液滴内细菌存活的数字检测，该流程为研究抗生素耐药性及鉴定未知化合物的抗菌活性提供了定量平台。
研究背景：液滴微流控技术已成为数字生物学的重要使能技术，其将生物检测结果处理为二值信号（0为阴性、1为阳性），在核酸检测（如数字PCR）及微生物药敏测试中取得成功。然而，现有数字方法仅适用于可简单阈值化的荧光信号，无法揭示哪些细胞能够在抗生素作用下存活及其存活方式，也难以提供存活细胞的复杂信息。形态学长期被视为微生物胁迫响应的可靠标志，在菌落尺度上已用于菌种鉴定并结合人工智能（AI）分析，在单细胞尺度上也已通过电子显微镜及高分辨率荧光成像结合图像分析开展细胞学 profiling（cytological profiling），提取面积、长度、圆度等形态描述符，以关联抗生素作用机制并识别易感亚群；机制研究亦表明特定形态可指示介导细胞逃逸抗生素的生物学修饰。本研究据此将数字框架拓展至包含抗生素胁迫下存活细胞的形态学，研究人员以大肠杆菌（E. coli）在抗生素中过夜培养并高分辨率观察其形状，构建自动化工作流与分析流程，获得涵盖82,000个液滴与168种抗生素条件（种类与浓度）的数据集，并利用神经网络对每个液滴中各形态的存在（1）或缺失（0）进行标注，从而得到存活细胞后代形态的多维特征谱。
主要技术方法（不超过250字）：研究采用静止微流控芯片，其腔室顶部图案化500个微流控锚定结构（anchor），每个锚定结构内形成约2 nL的独立液滴，实现单细胞封装与隔离培养；使用带405红色荧光蛋白标记（lacYZ:mRFP-1）的大肠杆菌W3110菌株，以20×0.7 NA物镜进行纺锤盘共聚焦显微镜（spinning disk confocal microscopy）成像，采集明场全芯片图像及25层Z轴堆栈；通过模板匹配自动检测液滴位置并裁剪图像，数据以SQLite关系数据库组织，并借助基于网页的交互平台完成语境相关（用于质控排除）与语境无关（用于形态标注）两类标注；以ResNet-34卷积神经网络（CNN）结合迁移学习进行多标签分类训练；最小抑菌浓度（MIC）采用肉汤微量稀释法测定。
研究结果：
实验方案与液滴内容物描述：研究遵循先前方案的微流控实验流程，芯片先充填氟化油再注入细菌与抗生素悬液，重新引入油相后于每个锚定结构内形成单个液滴，500个微液滴相互隔离且无营养灌注，2 nL液滴中单细胞浓度相当于5×10? cells/ml，与常规过夜培养起始浓度相当。研究人员定义五类非互斥形态标签：阳性（positive，成功成菌落）、浮游（planktonic，单个细胞悬液呈小点状）、团簇（clumped，细胞黏附成固状团块）、杆状（rod，长于浮游态但未充满液滴宽度）与丝状（filament，长而弯曲常充满液滴）。结果表明同一液滴常同时含多种形态，形态并非特定抗生素所独有，且形态与液滴内细菌数量无明显关系。
数据管理与图像动态交互：针对每次实验运行产生62 GB数据、难以动态交互的问题，研究实施预处理流程，将荧光堆栈最大投影后与明场图像拼接保存为多尺度zarr数组，模板匹配检测锚定结构坐标并裁剪300×300像素液滴图像，以SQLite分层数据库关联液滴、芯片与数据集标识及元数据；通过网页平台实现两级交互标注，语境相关界面显示全芯片低分辨率图像用于质控（排除无液滴、合并液滴、荧光碎片、过大或过小液滴及错位裁剪），语境无关界面随机显示单液滴高分辨率图像用于形态标注。
神经网络的训练与验证：由单一标注者对1,184个液滴完成语境无关标注，按70:30划分为训练集与测试集且标签分布可比，最稀有形态（丝状）出现于逾20%液滴中。研究采用34层ResNet-34卷积神经网络并迁移学习（ImageNet预训练权重初始化），以加权二元交叉熵带logit损失优化，采用多标签而非多分类设置使各标签独立预测。结果显示训练与验证平均损失均下降收敛，训练集子集准确率近完美而验证集饱和于约65%；精确率、召回率与F1分数表明阳性与浮游标签得分高于95%，其余标签至少80%，且召回率与精确率相近；验证集logit分析显示阴性标签聚集于负值，阳性与浮游标签多聚集于较大logit值；假阳性多见于人眼亦难判断的图像，杆状与丝状间存在混淆。
不同抗生素浓度下的细菌形态类型：神经网络对全部未标注液滴分类，每条抗生素条件获得319–9,202个液滴标签，合计82,268个液滴。结果验证阳性液滴比例随抗生素浓度升高而下降，与肉汤实验所得MIC（庆大霉素0.5 μg/mL、环丙沙星1.25 ng/mL、氨苄青霉素4 μg/mL、四环素64 μg/mL、氯霉素4 μg/mL）吻合良好，惟氯霉素重复间差异较大。以阳性液滴为条件的分析表明浮游表型几乎见于所有阳性液滴（高浓度环丙沙星略降），团簇常与浮游共存（无抗生素时亦如此），但氯霉素在极低浓度即几乎消除团簇形态，提示该药抑制细胞表面黏附分子；杆状与丝状在不同抗生素下程度不一，四环素不形成伸长形态，庆大霉素仅产生短直杆状，环丙沙星以长弯丝状为主，氨苄青霉素与氯霉素兼有杆状与丝状。与既往报道相比，本研究提供更标准化分类：氨苄青霉素相关丝状实为短杆状，环丙沙星为长弯丝状，庆大霉素伸长对应杆状，氯霉素则杆状与丝状共存。四环素与氯霉素虽均靶向蛋白质合成（分别结合30S与50S核糖体亚基），但表型迥异，提示氯霉素强烈改变细胞功能而四环素未见。
多维数字特征谱：研究以单个芯片中液滴呈阴性的概率替代抗生素浓度作为共同尺度，提供每次实验的抗生素效力内部度量并减少微生物实验常见的重现性问题。结果显示杆状与丝状形态在不同杀灭概率下出现且增长速率因抗生素而异，表明导致这些形态的胁迫与药物杀灭能力间接相关；团簇表型在氯霉素下迅速消失，在氨苄青霉素与环丙沙星下消失较慢，在四环素与庆大霉素下保持恒定。利用液滴封装可计算考虑多种形态共存的多维特征谱，结果显示每种抗生素随浓度呈现独特特征，可识别哪些形态共同出现或互斥；在高抗生素浓度下仅少数细胞存活时，多种形态可追溯至单个母细胞的后代，表明连续分裂可产生形态组合不同的群体。
讨论部分总结：本研究的测量得益于微流控、显微镜与软件方面的同步发展，各要素经验证整合后工作流可扩展至数百万液滴图像（包括延时成像），硬件与软件工具已在开源平台提供，可用于广泛微生物（如不同细菌或酵母菌株）的多种微生物学问题。生物学意义与未来展望：将研究拓展至不同细菌或可通过对未知病原体感染测量其抗生素胁迫下多维形态特征谱以鉴定菌种；本研究通过观察每个液滴中形成菌落的能力直接将形态多样性与存活关联，尤在仅少数细胞存活的高浓度下更具意义，以菌落形成潜力作为芯片内标度可在统一尺度比较不同抗生素条件并判断多样性变化；与既往表征菌落或单细胞形态的工作相比，本研究表征了结合个体细胞形状及其相互作用（如团簇）的“集体尺度”行为，为数字生物学增添了此前仅在小样本重复中研究的集体度量维度，若实现液滴内细胞行为的更深表征，或有助于阐明由局部群体动力学介导的抗生素耐药机制。研究局限性：平台要求荧光细菌，限制其在非实验室菌株及临床、兽医或生态应用中的适用性，需发展无需荧光的形态成像模态；需评估所观察各形态的生物学意义以重新定义标签使其具生物学信息，如区分丝状与细胞链、细胞层面与群体层面描述符；其他细菌物种可能呈现当前数据库未涵盖的形态。研究结论：该工作流通过结合液滴内细菌存活的数字检测与神经网络提取的多维形态特征谱，实现了抗生素条件下细菌存活与形态异质性的定量关联，为抗生素耐药性研究及未知化合物抗菌活性鉴定提供了定量平台。
