缺乏线粒体DNA的酿酒酵母突变体在单位生物量初始发酵速率上高于野生型

《Fermentation》：Saccharomyces cerevisiae Mutants Lacking Mitochondrial DNA Initially Ferment at Higher Rates per Unit of Biomass than Their Wild-Type Counterparts

　　

中文摘要翻译： 研究人员比较了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ρ0突变体与同源野生型菌株的初始乙醇生产能力，以避免酒精毒性影响发酵结果。本研究使用了BY4741菌株与Δccm1突变体杂交产生的减数分裂后代（meiotic segregants），以纳入生物学变异。研究人员利用CO2传感器在前10分钟内测定葡萄糖发酵速率，并通过600 nm分光光度法测定生物量。采用比色法测定酒精浓度和NAD+/NADH比率。RNA测序（RNA sequencing）用于评估参与糖酵解、发酵、NAD+依赖性调控及电生线粒体膜电位（electrogenic mitochondrial membrane potential）生成的相关基因表达。逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR）用于测定细胞质核糖体RNA水平。ρ0突变体单位生物量产生的CO2比野生型多63%，这一结果通过乙醇产量得到证实。然而，其倍增时间显著延长，这是ρ0突变体的典型特征。突变体还表现出较低的NAD+/NADH比率、较高的细胞质核糖体RNA水平，以及多个糖酵解和酒精发酵基因的上调，其中TDH3表达量增加超过4倍，这些均有利于提高单位生物量的乙醇产量。这些发现揭示了在不受酒精毒性影响的条件下影响酒精产量的遗传和生化因素。

论文主体内容解读

一、研究背景与科学问题

线粒体在酿酒酵母酒精发酵过程中的作用一直是发酵生物学研究的重要课题。以往研究比较了呼吸缺陷型菌株（ρ⁰或ρ^?，即缺乏完整线粒体基因组的菌株）与野生型菌株的发酵表现，但这些实验的培养时间通常超过一天，导致乙醇在细胞中大量积累。由于乙醇具有毒性，会影响细胞膜完整性、蛋白质构象、生长和代谢，而野生型细胞对乙醇毒性的耐受性更强，且能通过呼吸作用消耗乙醇，因此这些长期培养的实验结果实际上混淆了线粒体功能与乙醇耐受性两个因素。如果在发酵起始阶段、培养基中乙醇浓度尚低、细胞尚无需进行解毒时比较两类菌株的发酵速率，结果可能截然不同，因为此时线粒体功能尚未成为干扰因素。

另一个关键因素是细胞质NAD⁺/NADH比率，该比率在发酵起始阶段（线粒体酶活性受抑制时）尚未在ρ⁰细胞与野生型之间进行过比较。NAD⁺在甘油醛-3-磷酸脱氢酶（由TDH2和TDH3编码，其中异构体3贡献60%的活性）催化的反应中被消耗并产生NADH；同时，该辅因子也是细胞质乙醇脱氢酶（由ADH1编码）将乙醛还原为乙醇所必需的。较低的NAD⁺可用性会降低Sir2p和Hst1p的活性，这两种蛋白通过将乙酰基从蛋白质转移到NAD⁺上来沉默基因表达，其功能完全依赖NAD⁺。被Sir2p和Hst1p沉默的基因包括ENO2、CPC19和PDC1，这些基因编码关键的糖酵解和发酵酶。因此，呼吸缺陷型突变体中较低的NAD⁺/NADH比率应转化为受沉默子调控基因的更高表达。

由于线粒体基因组编码电子传递链的多个必需组分，缺乏线粒体DNA（mtDNA）的ρ⁰突变体无法进行有氧呼吸，只能通过糖酵解和酒精发酵获取全部细胞能量。mtDNA的缺失还通过破坏RIM15磷酸化促进乙醇生产。Rim15p是一种PAS激酶，介导酵母细胞进入静止期，从而抑制发酵。当RIM15被破坏或删除时，菌株的CO₂产量增加近30%。

本研究采用单一CCM1基因缺失突变体（Δccm1）作为ρ⁰菌株。CCM1基因产物（Ccm1p）最初被鉴定为去除细胞色素b和细胞色素c氧化酶亚基I前体mRNA第四内含子的必需加工因子，这两种蛋白是电子传递链复合物III和IV的组分。后来发现Ccm1p还负责维持线粒体核糖体小亚基RNA（15S rRNA）的稳态水平，其作用在于加工双顺反子15S rRNA-转运RNA^trp转录本的5′和3′末端，否则该转录本会被线粒体核酸外切酶Dss1p降解。因此，Ccm1p通过其双重加工功能，对产生成熟的线粒体核糖体组分至关重要。线粒体翻译的缺失会导致mtDNA随时间丢失。由于缺乏线粒体翻译，Δccm1突变体是没有电子传递链的ρ⁰细胞，无法通过氧化磷酸化产生能量。实验证据支持这一假设：Δccm1突变体在不可发酵培养基上产生约1000个细胞的微小菌落，无法在甘油培养基上继续传代，且缺乏mtDNA特有的点状细胞质 foci。

基于Δccm1突变体作为ρ⁰细胞的特性，研究人员假设重新暴露于新鲜葡萄糖培养基会使这些细胞以高于野生型的速率从葡萄糖产生乙醇，前提是它们具有显著较低的NAD⁺/NADH比率。为验证这一假设，本研究比较了两个同源菌株（野生型菌株和Δccm1突变体）杂交产生的减数分裂后代，目的是增加遗传变异，并确定只要突变体缺乏CCM1基因，观察到的效应是否具有普遍性。

二、研究内容与主要结论

为理解线粒体能量产生和mtDNA的缺失如何影响酒精发酵的不同方面，研究人员在乙醇毒性成为混淆因素之前，测定了发酵速率、直接参与酒精发酵及其调控的基因表达水平、NAD⁺/NADH比率，以及受细胞质NAD⁺水平影响的核糖体RNA积累情况。Δccm1突变体表现出显著更高的单位细胞酒精发酵速率，大多数糖酵解和发酵基因（包括葡萄糖转运蛋白HXT1）上调，NAD⁺/NADH比率降低，沉默子SIR2和HST1以及发酵抑制剂MSN2、MSN4和RIM15表达下降，细胞质rRNA产生增加。

三、关键技术方法

本研究使用BY4741野生型菌株（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）与Δccm1突变体菌株（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 ccm1Δ0::kanMX）杂交产生杂合二倍体，经减数分裂和四分体显微解剖获得独立野生型和突变型减数分裂后代群体。主要技术方法包括：CO₂气体传感器实时测定发酵速率；分光光度法测定生物量（600 nm吸光度）；比色法测定乙醇浓度和NAD⁺/NADH比率；RNA测序（RNA-Seq）定量糖酵解、发酵、NAD⁺依赖性调控及线粒体膜电位相关基因的转录组；逆转录定量PCR（RT-qPCR）测定细胞质18S rRNA和25S rRNA水平；DAPI染色和定量PCR确认突变体缺乏mtDNA；亚甲基蓝染色法评估细胞活力。

四、研究结果

3.1 减数分裂后代在YEPD上产生不同大小的菌落

四分体解剖平板在30°C孵育6天，分别在第2、3、6天拍照记录菌落大小。野生型菌株总是形成最大的菌落，能在YEPG（含甘油不可发酵培养基）上生长（表明线粒体功能正常），但不能在YEPD-G418上生长。突变体菌株形成显著较小的菌落，不能在YEPG上生长（表明缺乏功能性线粒体），但能在YEPD-G418上生长（表明含有赋予抗生素抗性的KanMX cassette）。Δccm1减数分裂后代形成较小的菌落，反映其倍增时间比野生型更长。这种生长缺陷可能由ρ⁰突变体维持最小线粒体膜电位（MMP）的反向电生机制解释。该应急生存适应涉及PET9（主要从细胞质导入ATP的转运体）、ATPase F₁组分（水解ATP产生ADP）以及组装因子FMC1。这种ATP/ADP交换产生维持线粒体必需分子导入所需的最小MMP，对酵母细胞造成重大能量消耗，细胞将糖酵解和发酵产生的ATP用于维持MMP而非增殖。重要的是，ρ⁰细胞不表达ATP6、ATP8或ATP9（均由mtDNA编码的F₀亚基组分，负责将ADP转化为ATP），但表达PET9、另外两个次要转运体及F₁亚基所有组分，尽管ATP1、ATP2、ATP3和ATP16水平显著低于野生型。相比之下，ATP11、ATP12和FMC1在突变体中表达更高，其中ATP11显著升高。

3.2 CO₂传感器系统的验证

CO₂在酒精发酵的倒数第二步产生，即丙酮酸被丙酮酸脱羧酶转化为乙醛时。该酶将糖酵解终产物丙酮酸导向乙醇生产，而非其他主要代谢途径（三羧酸循环/有氧呼吸或糖异生）。因此，从代谢角度看，测量CO₂水平是实时确定发酵速率的有效方法。为验证传感器并确定线性范围，研究人员测量了四种不同生物量（以AU计）的突变酵母在10分钟内的CO₂产量。生物量（AU）与CO₂产量（μmol）之间的关系在生物量达到至少200 AU之前呈线性，实际实验未达到该值。简单线性回归模型的相关系数R为0.9928，p值为0.0072。

3.3 突变酵母克隆的葡萄糖发酵速率显著高于野生型

将15小时龄的野生型和突变型克隆转移到新鲜YEPD后，在10分钟内测量CO₂产量，排除了线粒体功能障碍作为混淆因素，揭示了ρ⁰细胞在毒素积累并影响它们之前实际的葡萄糖发酵能力。突变体的中位倍增时间比野生型长27%（p < 0.0001，n = 16）。突变体克隆单位生物量（AU）产生的CO₂比野生型多63%（中位数比较，p = 0.0031，n = 16），两种菌株具有相同的活力。通过测量发酵速率最高的野生型和突变型克隆（各四个）的乙醇产量证实了这一结果，突变体的乙醇产量高出2.5倍（中位数比较，p = 0.0286，n = 8）。比较两组均值时，突变体产生的酒精是野生型的2.55倍，与CO₂值2.44非常接近。由于数据分布未通过正态性检验，该集中趋势度量不能用于统计计算。CO₂和乙醇产量在突变体和野生型克隆中高度相关，相关系数为0.8266，p值为0.0114。然而，由于突变体存在严重的生长缺陷，除非部分ATP能用于细胞增殖，否则它们不适用于工业环境。

3.4 突变克隆显著过表达15种糖酵解和乙醇产生酶中的11种

为阐明这些发现的代谢基础，研究人员选择了三个野生型和三个突变体克隆进行代表性转录组分析。选择标准包括：野生型产生大菌落，倍增时间约1.75小时，10分钟内每AU产生1.0至1.2 mmol CO₂；突变体产生小菌落，倍增时间2.2至3.3小时，10分钟内每AU产生2.2至3.1 mmol CO₂。通过确认三个Δccm1克隆中CCM1转录缺失验证了结果。在涉及葡萄糖转运、糖酵解和酒精发酵的所有基因中，11/15个基因（包括葡萄糖转运蛋白HXT1）表现出显著的2至4倍表达增加（p < 0.05）。值得注意的是，在突变体克隆中，TDH3（最丰富的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，产生NADH，即酒精发酵最后一步将乙醛还原为乙醇所需的辅因子）上调超过4倍。此外，尽管PGM1在野生型酵母中编码次要的磷酸葡萄糖变位酶异构体，突变体中PGM1和PGM2表达无差异，但突变体克隆的PGM1表达量是野生型的两倍以上（p < 0.05）。因此，线粒体功能障碍与糖酵解和酒精发酵途径中许多基因的更高表达相关，但两个磷酸果糖激酶亚基除外。

3.5 突变克隆中的基因转录调控有利于CO₂和乙醇的产生

与TDH3和ADH1转录水平一致，突变体的NAD⁺/NADH平衡降低了近2倍（突变体/野生型比率为0.57；p = 0.008；n = 6）。在细胞质中，TDH3通过消耗NAD⁺影响核内NAD⁺水平，从而控制完全依赖该辅因子的沉默子SIR2和HST1的活性。沉默子SIR2和HST1抑制编码关键发酵酶的基因表达，包括ENO2、CDC19和PDC1。Sir2p和Hst1p结合这些发酵基因的开放阅读框，在呼吸能力正常的细胞进入双峰转换时降低其转录。研究结果显示了沉默子表达与发酵基因表达之间的负相关：突变体中ENO2、CDC19和PDC1显著上调超过3倍，而SIR2和HST1转录水平仅为野生型的一半（突变体/野生型比率分别为0.51和0.48；p < 0.05；n = 6）。

沉默基因表达的减少和NAD⁺水平的降低创造了有利于突变体中观察到的相对增强发酵途径的条件。为独立确认这些发现，研究人员测量了细胞质rRNA水平，突变体中25S rRNA和18S rRNA分别增加40%和43%（p < 0.05，n = 6）。

在酿酒酵母中，RIM15基因编码一种蛋白激酶，作为酒精产生的"抑制剂"。天然存在的RIM15功能缺失突变（在传统清酒酵母中常见）通过将酵母的能量从形成储存碳水化合物（合成代谢）转向将糖分解为乙醇（分解代谢）来提高初始酒精发酵速率。与缺失或突变的RIM15强烈偏向细胞进行酒精发酵一致，突变体克隆中观察到RIM15表达降低（突变体/野生型比率为0.65；p = 0.0309；n = 6）。

NAD⁺依赖性Sir2p抑制rDNA表达，因为在所有SIR基因中只有SIR2的缺失能增强细胞质rRNA表达。SIR2和HST1表达降低与RDN 18-1、RDN18-2、RDN 37-1和RDN 37-2表达的显著增加相关。RDN 18-1和RDN18-2编码18S rRNA，而RDN 37-1和RDN 37-2编码35S rRNA转录本，该转录本进一步加工为25S、18S和5.8S rRNA。RNA-seq和qPCR测得的rRNA水平增幅不匹配，因为靶标和技术不同，但两种方法均显示相同趋势：突变体克隆中rRNA表达上调。

酿酒酵母清酒菌株的高发酵速率归因于转录因子MSN2和MSN4的缺失。在本研究使用的参考菌株BY4743（所用菌株的二倍体版本）中删除这些基因，在含20%葡萄糖的YEP中30°C孵育三至四天后，与野生型菌株相比显著增加了CO₂产量，双突变体增幅最大。本研究的ρ⁰克隆表达的这些转录因子水平显著低于野生型菌株，MSN2分别为100 ± 8 TPM对比165 ± 9 TPM，MSN4分别为109 ± 21对比181 ± 24（p值分别为0.0028和0.0429；n = 6）。因此，线粒体功能障碍与损害酿酒酵母酒精发酵的基因表达显著降低相关。

突变体具有较低的NAD⁺/NADH比率，这对糖酵解和发酵基因的调控具有重要意义。NAD⁺是沉默子Sir2p的必需辅因子，Sir2p抑制PDC1、ENO2和CDC19的表达。此外，Sir2p和另一个沉默子Hst1p结合这些基因和TDH3。突变体中糖酵解和发酵基因的表达显著上调超过两倍。这一增加对TDH3尤为重要，因为该酶产生NADH，使其可供Adh1p（也上调）用于乙醇生产。突变体中过量的NADH反映了TDH3和ADH1表达水平的差异：突变体中TDH3与ADH1的比率为3.04，而野生型为1.78。因此，与野生型相比，突变体产生的NADH显著多于消耗的NADH（p值 = 0.0193；n = 6）。总之，突变体中TDH3和ADH1的差异上调产生了过量NADH，从而降低了NAD⁺水平，因为NAD⁺是NADH的前体。由于NAD⁺是Sir2p/Hst1活性所必需的，较低的NAD⁺水平降低了它们的沉默活性，可能上调了多个糖酵解和发酵基因。

3.6 TDH3转录因子和TDH3旁系同源物的表达

高TDH3表达（糖酵解所需）依赖于GCR1和RAP1编码的转录因子。Vande Zande等人还表明TDH2共享相同的调控机制，当启动子突变影响GCR1和RAP1结合位点时，以剂量依赖性方式补偿TDH3表达的缺失或减少。此外，这些突变消除了补偿性TDH2上调，表明两个基因共享Gcr1p和Rap1p。这些转录因子据报道还调控其他参与糖酵解和酒精发酵的基因，包括PGK1、ENO1、PYK2和ADH1。另一项研究表明Tdh1p水平在静止期（葡萄糖浓度低时）强烈增加。然而，在活跃酒精发酵期间（其他多肽表达最高时），Tdh1p检测不到。本研究中，突变体中所有三种异构体均显著上调；然而，生物学变异使TDH1无法达到统计显著性。在本实验条件下，TDH1和TDH2表达仅占总TDH表达的三分之一。

五、讨论与结论

Δccm1突变体在单位生物量基础上初始发酵葡萄糖产生乙醇的速度快于同源野生型。然而，尽管这些突变体缺乏mtDNA，它们仍表达参与形成最小线粒体膜电位的基因。产生最小膜电位可能消耗了糖酵解产生的一部分ATP，从而减缓了突变体的生长。由于突变体中TDH3与ADH1的表达比率高于野生型，突变体消耗的NAD⁺多于产生的NAD⁺，导致NAD⁺水平降低。相对较低的NAD⁺水平抑制了沉默子Sir2p和Hst1p，从而上调了多个参与乙醇和细胞质rRNA产生的基因。总之，这些发现揭示了在不受酒精毒性影响的条件下影响乙醇产量的遗传和生化组分。