《Heliyon》：Structure-based virtual screening of cyanobacterial metabolites against key influenza A virus targets
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甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）仍是全球健康和畜牧业的主要威胁，因此需要发现新的抗病毒药物。本研究对1288种蓝藻次生代谢物针对关键IAV蛋白进行了基于结构的虚拟筛选（structure-based virtual screenin
甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）仍是全球健康和畜牧业的主要威胁，因此需要发现新的抗病毒药物。本研究对1288种蓝藻次生代谢物针对关键IAV蛋白进行了基于结构的虚拟筛选（structure-based virtual screening），这些蛋白包括血凝素（hemagglutinin, HA；H3和H5）、神经氨酸酶（neuraminidase, NA；N1和N2）以及RNA聚合酶亚基（PB2和PA）。分子对接（molecular docking）采用AutoDock Vina，以刚性受体–柔性配体方法进行，并结合对接评分、分子大小、结合取向及与功能关键残基的相互作用评价结合构象。多靶点对接策略结合多项对接相关标准，识别出若干候选物，其对H3、H5、N1和N2的预测对接评分优于相应天然配体，但对PB2和PA的评分略差。关键化合物包括11,12-didehydrospironostoic acid、7-formyl-3-methoxy-5-methylindanone、mycosporine-glycine-alanine、palythine-serine、Asterina-330、toyocamycin、usujirene、tjipanazole衍生物、tubercidin和didmolamide A。值得注意的是，在优先候选物中，来自Calothrix的代谢物表现出最广的预测多靶点结合谱，其次为Tolypothrix；而来源于Lyngbya/Moorea、Scytonema、Leptolyngbya、Nostoc和Fischerella的化合物则显示靶点特异性或有限的多靶点结合谱。基于骨架的分析揭示了关键结构类别，包括核苷样化合物、类菌胞素氨基酸（mycosporine-like amino acids, MAAs）以及肽/生物碱衍生物，这些结构有助于与功能关键残基形成有利的预测结合相互作用。ADMET（absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity，吸收、分布、代谢、排泄和毒性）评价显示，优先候选物的预测药代动力学和毒性特征存在差异，其中若干候选物具有低预测小肠吸收（human intestinal absorption, HIA）或较高致突变性风险，提示需要进一步的安全性和药代动力学评价。总体而言，本研究凸显蓝藻代谢物作为结构多样且研究不足的潜在IAV多靶点抗病毒候选物来源，并为未来计算优化和实验验证提供了框架，以服务于人类和动物健康应用。
甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）属于正黏病毒科，是有包膜、含8段单链RNA的病毒，可感染禽和猪并具有人兽共患潜力。其表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin, HA）和神经氨酸酶（neuraminidase, NA）的抗原特性决定亚型分类，频繁突变和基因重配可导致新变异株、周期性暴发和大流行。高致病性禽流感H5N1可在家禽中造成严重暴发，猪流感H1N1、H1N2和H3N2广泛分布；H5N1在美国奶牛中的传播进一步提示IAV持续演化。当前抗病毒干预有限：NA抑制剂（如oseltamivir、zanamivir和peramivir）和M2离子通道阻滞剂存在成本高、对新兴株效果下降及耐药快速发展等问题；家畜尚无获批抗病毒药物；疫苗交叉保护有限且难以快速匹配变异株。天然产物因结构多样和广谱生物活性成为抗病毒药物的重要来源。蓝藻可产生多样次生代谢物，但其低分子量次生代谢物的抗IAV潜力较抗菌、抗癌研究明显不足；既往天然产物抗IAV研究多使用有限化合物库并主要针对单一病毒蛋白（如HA或NA），可能忽略多靶点活性。研究人员此前已用类似计算流程对蓝藻代谢物抗SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）和木瓜样蛋白酶（PLpro）进行结构虚拟筛选，但局限于冠状病毒蛋白酶，未研究可靶向多个病毒蛋白的化合物。为此，本研究扩展至IAV六个结构与功能不同的蛋白，并加入跨靶点优先排序和ADMET评价。
研究人员从CyanoMetDB（Version 3，2024年9月发布）获取3084种蓝藻次生代谢物，按分子量>700 g/mol及柔性过高排除后保留1288种；由PubChem获取结构，Open Babel生成3D坐标，MMFF94力场能量优化。靶点包括H3（PDB ID: 2YP9）、H5（1JSO）、N1（2HU4）、N2（4GZP）、PB2（5WL0）和PA（6FS6）；MGLTools制备受体与网格盒，AutoDock Vina 1.2.3以刚性受体–柔性配体对接，exhaustiveness=12、num_modes=10、能量范围4 kcal/mol；重对接均方根偏差（root mean square deviation, RMSD）为0.269–1.600 ?，用于验证对接方案；按对接评分、分子量、关键残基相互作用和结合取向进行多标准优先排序；对入选化合物用admetSAR 3.0预测ADMET及Lipinski五规则（Lipinski's rule of five）。研究结论提示，若干蓝藻次生代谢物对H3、H5、N1和N2的预测对接评分优于相应天然配体，对PB2和PA略差；Calothrix来源代谢物显示最广预测多靶点结合谱，Tolypothrix次之；核苷样、MAAs和肽/生物碱等骨架与关键残基有利相互作用相关；ADMET预测存在吸收和毒性差异，需进一步评价。其意义在于为蓝藻代谢物作为IAV多靶点候选物提供初步计算证据和优先排序框架，但抗病毒效力仍需实验验证。
3.1 血凝素靶点。通过H3 HA晶体结构关键残基分析与分子对接，研究人员将D190、T135和S137作为天然配体识别的关键基准；11,12-didehydrospironostoic acid（Calothrix）在结合亲和力、分子大小、取向和关键残基作用间较平衡，与D190、T135及Y98、S228形成极性/稳定接触；7-formyl-3-methoxy-5-methylindanone（Lyngbya/Moorea）结合D190和S137，显示互补模式；Calothrix和Lyngbya/Moorea贡献多个有利代谢物，Aphanizomenon、Blennothrix和Nostoc的个别化合物也与关键残基作用。通过H5 HA结构分析，Q222被确定为关键残基，并参考E186、H179、Y91、S133和S132；mycosporine-glycine-alanine（Sphaerospermopsis）结合Q222、E186和Y91，形成稳定网络；palythine-serine（Scytonema）结合Q222和S133并形成附近氢键，取向稳定；Sphaerospermopsis和Scytonema候选被优先，Calothrix、Leptolyngbya和Nostoc的附加代谢物显示有利评分和相互作用，Synechocystis和Tolypothrix的个别化合物亦与关键残基作用。
3.2 神经氨酸酶靶点。通过N1 NA活性位点分析与对接，R292、R371、Y347、D151和R152被作为保守识别残基；Asterina-330（Lyngbya）与R292、R371、D151及R118、E277、Y406形成关键极性接触，结合取向明确；toyocamycin（Tolypothrix）与D151、R371、Y347及Y406作用，提示对N1结合环境具特异性；Lyngbya和Tolypothrix的代谢物被优先，Aphanothece、Calothrix、Hapalosiphon、Lyngbya/Moorea、Nostoc和Scytonema的附加化合物也显示有利预测。通过N2 NA分析，同样保守残基R292、R371、Y347、D151和R152用于评价；Asterina-330在N1/N2间表现一致，结合R292、R371、D151及R118、Y406；usujirene（Synechocystis）结合R292、D151、R371及R118、E276，支持其作为选择性N2抑制候选；Lyngbya和Synechocystis被优先，Calothrix、Fischerella、Hapalosiphon、Scytonema和Tolypothrix的化合物也有利。需要指出，详细结构分析按多标准框架选择，而非仅按预测对接评分排序。
3.3 RNA聚合酶靶点。通过PB2亚基结构分析，V511、K376、R355和E361被作为关键相互作用位点；Tjipanazole M（Fischerella）与V511、E361及S337形成极性/稳定接触，结合取向稳定；tubercidin（Tolypothrix）与V511、E361及S337作用，提示一致且特异的PB2活性位点结合模式；Fischerella和Tolypothrix被优先，Aulosira、Leptolyngbya、Lyngbya/Moorea、Nostoc和Rivularia的附加化合物也显示有利预测。通过PA亚基分析，E119、D108和I120被作为配体识别关键残基；Tjipanazole C1（Tolypothrix）与E119、D108及E23、Y24、E80作用，取向稳定；didmolamide A（Prochloron）与E119、D108及K137作用，支持其作为PA选择性抑制候选；Tolypothrix和Prochloron被优先，Lyngbya/Moorea、Nodularia和Sphaerospermopsis的化合物也有利。PA对接在去除金属离子后进行，原文提示其结果需谨慎解释。
3.4 ADMET和成药性分析。通过对入选化合物用admetSAR 3.0预测，研究人员发现理化、药代和毒性特征差异明显；部分化合物符合Lipinski五规则，另一些显示低预测HIA或较高Ames致突变性概率。对接优先并不必然对应有利ADMET。Asterina-330、palythine、mycosporine-glycine-alanine、palythine-serine、usujirene和toyocamycin的预测HIA概率为0.17–0.48；Tjipanazole C1、Tjipanazole M和Didmolamide A的预测Ames致突变性概率分别为0.95、0.89和0.94；toyocamycin和tubercidin为已知细胞毒性核苷抗生素，提示需同时评价宿主细胞毒性。ADMET分析仅针对入选化合物，未覆盖全部1288种代谢物，结果被视为初步开发限制指标而非药物适用性证据。
讨论部分总结：本研究以多靶点对接策略和ADMET评价扩展了天然产物抗IAV研究，跨靶点分析显示11,12-didehydrospironostoic acid（Calothrix）对H3、H5、N1和N2四个靶点有有利预测，spironostoic acid覆盖三个靶点，12-hydroxy-2-oxo-11-epi-hinesol覆盖两个靶点；toyocamycin（Tolypothrix）覆盖H5、N1和N2，tubercidin覆盖N2和PB2；Calothrix在优先化合物中多靶点谱最广，Tolypothrix次之，其他属多为靶点特异性或有限多靶点谱。骨架分析将有利结合归因于核苷样骨架、MAAs、吲哚/生物碱、肽/缩肽、聚酮/脂肪酸、小芳香/酚及混合骨架等结构类别；这些化合物中toyocamycin、tubercidin和Tjipanazoles也曾在此前SARS-CoV-2虚拟筛选中出现，但本研究针对结构功能不同的IAV蛋白进行优先排序。ADMET预测提示部分化合物存在低肠道吸收或致突变性担忧，且对接评分不能替代药代和安全评价。研究局限包括仅进行对接和ADMET预测，未进行分子动力学模拟或结合自由能计算；采用刚性受体模型，未考虑蛋白构象柔性；PA活性位点依赖金属离子，去除催化金属可能影响预测取向和评分；AutoDock Vina评分不确定性约2 kcal/mol，超过部分化合物间评分差异；PB2和PA入选化合物的对接评分略低于相应天然配体，因此多靶点结合谱应视为需实验验证的初步假设，后续需分子动力学、结合自由能、体外酶学、细胞抗病毒和体内效力评价。
研究结论翻译：总之，本研究通过整合蓝藻代谢物大规模筛选、多靶点对接策略和ADMET评价，推进了基于天然产物的抗病毒研究，为识别有前景的抗甲型流感病毒（IAV）候选物提供了系统方法。结果提示，所选蓝藻次生代谢物可能与参与进入、释放和复制的多个病毒靶点相互作用。若经实验验证，此类相互作用可支持具有降低耐药发展潜力的多靶点抗病毒策略。在优先化合物所代表的属中，Calothrix表现出最广的预测多靶点结合谱，其次为Tolypothrix，而其他属的代谢物显示靶点特异性或有限多靶点谱。基于骨架的分析进一步突出了与关键病毒蛋白残基形成有利预测相互作用的不同化学类别。ADMET预测为候选优先排序提供了附加标准，同时识别出与肠道吸收和毒性相关的潜在限制，强调在考虑实际应用前需进一步进行药代动力学和安全性评价。总体而言，这些发现支持对蓝藻代谢物，尤其是Calothrix和Tolypothrix来源代谢物，开展靶向生物勘探以用于未来抗病毒开发。在确定这些化合物是否适用于人类或动物健康应用（包括饲料添加剂）之前，仍需进一步计算优化和实验验证，包括抗病毒效力、药代动力学和安全性评价。
