牛磺酸缓解聚苯乙烯微塑料诱导的泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)仔鱼生长抑制与氧化应激

《Water》：Taurine Alleviates Polystyrene Microplastic-Induced Growth Inhibition and Oxidative Stress in Loach (Paramisgurnus dabryanus) Larvae

　　

微塑料（MPs）是广泛存在于多种水生环境中的新兴污染物，可被水生生物摄食并触发氧化应激损伤，抑制生长发育。牛磺酸是一种常见的功能性物质，具有优异的抗氧化应激特性。本研究旨在探究饲料中添加牛磺酸能否缓解聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）触发的氧化应激损伤，并分析其在泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）仔鱼中的潜在机制。泥鳅仔鱼暴露于1000 μg/L聚苯乙烯微塑料28天，并辅以梯度饲料牛磺酸添加（0.2%、0.4%、0.8%和1.6%），以探究牛磺酸的保护作用及调控机制。测定了生长状况、摄食能力、死亡率、抗氧化酶活性（SOD、CAT、GSH-PX）、MDA含量以及Nrf2/Keap1通路相关基因的表达。经28天PS-MPs暴露后，MP组累积死亡率为42.9%，其平均体重降至对照组的83.51%。饲料补充牛磺酸（≥0.8%）有效逆转了这些不良表型。值得注意的是，牛磺酸并未降低仔鱼体内微塑料的蓄积，表明其保护作用不依赖于微塑料摄食。此外，牛磺酸增强了抗氧化酶活性，减少了MDA蓄积，并缓解了氧化应激。在机制上，牛磺酸激活了Nrf2/Keap1信号通路，上调下游抗氧化基因表达，清除过量ROS，并在微塑料胁迫下维持抗氧化系统的稳定性。本研究提供了一种针对微塑料毒性的营养缓解策略，并增进了对微塑料给淡水养殖生态系统中底栖鱼类带来生态风险的理解。

研究背景方面，塑料制品因耐久性强、便携性好和成本低而被广泛用于日常生活和工业生产，聚苯乙烯（PS）因其良好的电绝缘性、高透明度和便利的加工性成为全球产量最大的塑料聚合物之一，但其为典型的不可生物降解材料，废弃塑料在物理或化学条件下逐渐破碎形成微塑料（MPs）。微塑料被定义为直径1微米至5毫米的塑料颗粒或碎片，通过地表径流、河流湖泊等各种工农业废水和生活污水途径进入水生环境。在养殖环境中，微塑料可能危害养殖水生生物并通过食物链传递蓄积，对人类健康构成潜在风险。已有报道表明淡水环境中微塑料丰度高于海洋环境，引发更复杂的生态毒性。在淡水生态系统中，微塑料广泛分布于水柱和沉积物等水生隔室中，可被滤食性和底栖生物摄食。鱼类因与水环境持续互动而尤其易受微塑料影响，多种暴露途径使鱼类能够摄取微塑料，对机体健康构成相当大的风险。日益增多的证据表明，微塑料可改变水生生物行为并破坏生态系统功能，微塑料颗粒对多种浮游和底栖物种的摄食活动、个体行为和发育产生不利影响。摄入的微塑料可能阻塞消化道、降低能量储备并抑制生长性能。此外，微塑料可穿透生物组织和细胞，触发活性氧（ROS）大量蓄积，破坏体内氧化还原平衡，诱导氧化应激损伤，进而引起细胞脂质过氧化、酶系统紊乱和基因表达异常，最终损害水生生物的生长、发育、繁殖和存活。牛磺酸（2-氨基乙磺酸）是一种含硫氨基酸，普遍存在于动物组织包括肌肉和肝脏中，在水生动物的生长、抗氧化能力、抗应激和免疫调节中发挥重要生理作用。牛磺酸能有效增强鱼、虾、蟹的内源性抗氧化能力，缓解重金属、氨氮和高温等多种环境胁迫诱导的氧化损伤。然而，牛磺酸能否缓解PS-MPs触发的生长抑制和氧化应激尚不清楚。泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）是典型的底栖鱼类，近年来中国养殖产量显著增长。在自然和养殖水体中，泥鳅直接暴露于水柱中悬浮的污染物以及沉积于底部的污染物。作为杂食性物种，泥鳅摄入污染物的量往往远大于草食性和肉食性鱼类，因此被采用为环境污染物评估的实验动物。鱼类仔鱼体型小且生理未成熟，更易受环境污染物影响，其发育和存活决定成鱼的生理特征和种群存续。因此本研究选择泥鳅仔鱼作为实验对象，以更好地验证牛磺酸对PS-MPs胁迫下鱼类仔鱼的保护作用。本研究旨在评估牛磺酸对摄食微塑料的泥鳅仔鱼的保护作用，并进一步探究饲料牛磺酸能否缓解PS-MPs诱导的泥鳅仔鱼生长抑制和氧化应激。研究人员评估了PS-MPs暴露下梯度牛磺酸补充对仔鱼生长和摄食性能、抗氧化酶活性及氧化应激相关基因表达变化的影响。本研究提供了一种降低泥鳅仔鱼养殖中微塑料风险的营养策略，并为缓解淡水底栖系统中微塑料污染提供了启示。研究人员开展的研究得出以下结论：环境相关浓度的聚苯乙烯微塑料显著抑制生长性能、增加死亡率并通过降低饱食率扰乱摄食行为；微塑料暴露还诱导严重的氧化应激损伤，表现为抗氧化酶活性紊乱和MDA过量蓄积；饲料补充牛磺酸有效改善微塑料诱导的生长迟缓、摄食障碍和氧化损伤；值得注意的是，牛磺酸的保护作用不依赖于减少泥鳅仔鱼微塑料摄食，且在0.8%及以上饲料牛磺酸水平下观察到该保护效应，表明牛磺酸通过内源性抗氧化机制发挥保护功能；牛磺酸激活Nrf2/Keap1信号通路，上调下游抗氧化基因表达，提高SOD、CAT和GSH-PX活性，减少MDA蓄积，这些响应有效清除过量活性氧并恢复氧化还原稳态，从而缓解微塑料触发的氧化损伤。总之，适当的牛磺酸补充（≥0.8%）可作为有效饲料添加剂抵抗微塑料胁迫，本研究为泥鳅苗种健康养殖和养殖生态系统微塑料污染的生态风险防控提供了理论基础。在技术方法上，研究人员以广东中山市某渔场获得的泥鳅受精卵孵化仔鱼为实验对象，设置1000 μg/L聚苯乙烯微塑料暴露浓度，配合0%、0.2%、0.4%、0.8%和1.6%梯度牛磺酸饲料，开展28天暴露实验，于第7天和第28天采样。主要关键技术方法包括：采用ImageJ软件进行生长性能测量（体长、体高、体厚及平均体重）；采用Kaplan–Meier法绘制生存曲线并统计饱食率和空腹率；采用荧光显微镜观察微塑料在组织中的分布，结合KOH消化与荧光显微镜计数定量微塑料负荷；采用商业试剂盒测定MDA含量及CAT、GSH-PX、SOD活性和总蛋白；采用qPCR检测cat、sod、gsh-px、keap1、nrf2和maf基因相对表达量，以β-actin为内参基因，采用2^?ΔΔCT法计算。研究结果方面，生长性能结果显示，28天暴露后CK组平均体重为2.79 mg/尾，MP组仅为2.33 mg/尾，为CK组的83.51%，MP+Tau（0.8%）组恢复至2.71 mg/尾；微塑料暴露显著降低平均体重（p<0.05），牛磺酸补充以剂量依赖方式改善微塑料触发的体重损失；微塑料暴露显著降低体长、体高和体厚均值（p<0.05），而最大值无显著差异，均值下降主要归因于较小规格个体比例升高，高于0.4%的牛磺酸补充可部分挽救这些不利影响。存活结果显示，28天后六组存活率分别为83.6%（CK）、57.1%（MP）、62.5%（MP+Tau[0.2%]）、63.3%（MP+Tau[0.4%]）、74.2%（MP+Tau[0.8%]）和77.5%（MP+Tau[1.6%]）；Kaplan–Meier生存分析显示MP组与CK组生存曲线显著分离（χ2=36.61，df=1，p<0.05），MP组与MP+Tau（0.8%）（χ2=14.25，df=1，p<0.05）及MP+Tau（1.6%）（χ2=23.39，df=1，p<0.05）间差异显著，而MP+Tau（1.6%）组与CK组间无显著差异（χ2=2.26，df=1，p>0.05）；第28天累积死亡率显示MP组、MP+Tau（0.2%）组和MP+Tau（0.4%）组显著高于CK组（p<0.05），而MP+Tau（0.8%）、MP+Tau（1.6%）组与CK组无显著差异。饱食率和空腹率结果显示，第7天各组饱食率和空腹率均无显著组间差异；第28天MP组饱食率为25.28%，显著低于CK组的33.27%（p<0.05），MP组空腹率显著升高至16.93%，显著高于CK组和四个牛磺酸补充组，MP+Tau（0.8%）和MP+Tau（1.6%）组空腹率低于MP+Tau（0.2%）和MP+Tau（0.4%）组，且与CK组无显著差异。微塑料分布结果显示，荧光显微镜观察发现荧光PS-MPs主要分布于肠道、口腔、咽和鳃，少量黏附于体表皮肤和鳍；合并明场和荧光图像显示消化道中荧光PS-MPs位置与食糜高度重叠，部分仔鱼鳃组织上观察到荧光PS-MPs聚集体；第28天KOH消化后荧光显微镜下所有PS-MP暴露组均可见绿色荧光标记PS-MPs，除完整球形颗粒外滤膜上还检测到小碎片，CK组样品未见荧光微塑料；定量显示MP组与四个牛磺酸补充组间PS-MPs丰度无显著差异，PS-MP碎片数量在MP组与牛磺酸补充组间亦无显著差异。酶活性结果显示，暴露7天后MP组SOD、CAT和GSH-PX活性显著升高，MP+Tau（0.2%）和MP+Tau（0.4%）组SOD和CAT活性低于MP组，而GSH-PX活性在MP组与这两个组间无显著差异，0.8%以上牛磺酸补充抑制了PS-MP诱导的SOD、CAT和GSH-PX活性升高，MP+Tau（0.8%）和MP+Tau（1.6%）组这些酶活性显著低于MP组但仍适度高于CK组；28天PS-MP暴露后MP组SOD、CAT和GSH-PX活性较CK显著降低，而MP+Tau（0.8%）和MP+Tau（1.6%）组这些酶活性较高；荧光PS-MPs暴露显著增加MDA含量（p<0.05），牛磺酸补充以明显剂量依赖方式减轻MDA蓄积。抗氧化相关基因表达结果显示，第7天MP组sod基因相对表达量为CK组的2.35倍，显著上调（p<0.05），牛磺酸补充后sod相对表达约为CK组的1.5倍，与CK组无显著差异（p>0.05）；第28天MP组sod相对表达较CK显著下调（p<0.05），MP+Tau（0.2%）和MP+Tau（0.4%）组显著高于MP组（p<0.05）且与CK组无显著差异，MP+Tau（0.8%）和MP+Tau（1.6%）组sod表达显著升高（p<0.05）；cat和gsh-px基因表达模式与sod相似，第7天MP组cat和gsh-px相对表达升高，第28天降低，牛磺酸补充显著上调MP+Tau（1.6%）组cat基因相对表达，第28天MP+Tau（0.8%）和MP+Tau（1.6%）组gsh-px表达显著高于CK组（p<0.05）；第7天MP组nrf2表达显著高于CK组，牛磺酸补充缓解nrf2表达的急剧升高，第28天MP组、MP+Tau（0.2%）组与CK组间nrf2表达无显著差异，0.4%以上牛磺酸补充维持较高nrf2表达；第7天MP组keap1表达较CK显著下调（p<0.05），饲料牛磺酸部分恢复keap1转录水平，虽仍低于CK组，第28天MP组keap1表达略有升高；第7天各组maf表达无显著差异，第28天MP+Tau（0.8%）和MP+Tau（1.6%）组maf表达显著高于其他处理组（p<0.05）。讨论部分总结如下：死亡率是评价环境污染物毒性效应的关键生物标志物，本研究中微塑料暴露显著增加泥鳅仔鱼死亡率，而牛磺酸补充有效缓解微塑料诱导的死亡率升高，表明牛磺酸对泥鳅仔鱼微塑料毒性具有保护作用；观察PS-MPs分布时发现鳃上附着微塑料团块，这些个体更显消瘦，鳃部微塑料蓄积可能通过破坏气体交换和鳃组织功能独立于胃肠道摄食导致死亡；已有研究证明微塑料摄食抑制多种水生生物生长，主要归因于骨骼和肌肉组织发育受损，本研究观察到微塑料暴露组泥鳅仔鱼体长、头长和体宽显著降低，提示微塑料暴露对泥鳅仔鱼骨骼和肌肉生长具有显著抑制作用，饲料牛磺酸补充可有效逆转这些不利影响；第28天MP组饱食率降低、空腹率升高，暗示高浓度微塑料或微塑料污染饲料暴露可能损害鱼类摄食选择性，导致被动摄入微塑料并进一步降低捕食能力和摄食效率，此外意外摄入微塑料可诱导水生生物假饱腹感，引起胃肠道阻塞和食欲抑制，被认为是摄食障碍的主导因素，而暴露早期饱食率和空腹率无显著变化可能归因于仔鱼早期发育阶段卵黄囊供能补偿了微塑料暴露诱导的生理应激；尽管饲料牛磺酸补充缓解了微塑料诱导的生长抑制，但其保护作用是通过促进仔鱼生长还是减少微塑料摄食尚不清楚，为阐明该机制研究人员测定了泥鳅仔鱼微塑料丰度，结果证实牛磺酸补充未减少仔鱼微塑料摄入，排除了减少MP摄食作为牛磺酸主要保护途径，将焦点转向抗氧化防御；饲料牛磺酸能增强肠道蛋白消化和氨基酸吸收，促进肌肉蛋白沉积和肌纤维发育，改善鱼类免疫能力和骨骼生长，但过量饲料牛磺酸会削弱其促生长作用，大口黑鲈（Micropterus salmoides）研究表明正常养殖条件下最大化生长率的最适饲料牛磺酸浓度为0.288%，而本研究中较高牛磺酸剂量（>0.8%）对微塑料胁迫表现出更优保护效果，表明水生生物需要更高牛磺酸水平以抵抗不利环境胁迫；从养殖角度看，饲料添加0.8%和1.6%牛磺酸对泥鳅仔鱼PS-MPs胁迫具有明显保护作用，已有研究表明饲料牛磺酸2.0%对Scophthalmus maximus和Megalobrama amblycephala不产生毒性效应，但考虑经济成本，在环境相关PS-MPs污染挑战下研究人员暂推荐泥鳅仔鱼养殖饲料牛磺酸添加水平为0.8%，以平衡保护效果和饲料成本；微塑料侵入鱼类后抗氧化系统首先被激活，触发大量活性氧（ROS）产生并破坏氧化还原平衡，鱼类具有完善的抗氧化网络以对抗ROS毒性影响，SOD和CAT作为核心内源性抗氧化酶构成对抗过氧化物自由基的主要防御屏障，SOD促进超氧阴离子歧化为过氧化氢，CAT随后将其分解为水和氧气，此外GSH-PX是必需的普遍存在的过氧化物酶，清除ROS过量产生时蓄积的过量过氧化氢并有效防止ROS蓄积，该酶已被广泛采用为水生毒理学中识别氧化应激的可靠生物标志物；已有研究表明高浓度微塑料暴露抑制水生生物SOD、CAT和GSH-PX活性，与双相氧化应激响应一致，本研究中MP组第7天SOD和CAT活性显著升高而第28天较对照组显著抑制，早期酶激活可解释为泥鳅仔鱼对微塑料胁迫的初始防御响应，微塑料入侵诱导过量ROS产生，SOD活性升高加速超氧阴离子转化为过氧化氢，进一步触发CAT和GSH-PX激活以清除蓄积的H₂O₂，然而持续ROS过量产生导致H₂O₂过度蓄积，最终对SOD和CAT活性产生抑制作用，长期微塑料暴露引起进行性生理损伤，损害抗氧化系统稳定性并最终抑制抗氧化酶能力；某些抗氧化饲料添加剂能够对微塑料引发的氧化损伤提供适度保护，番茄红素和柠檬酸等饲料补充剂可缓解微塑料触发的氧化损伤，这些添加剂抵消饲料微塑料的有害影响并恢复非洲鲶鱼（Clarias gariepinus）的血液学参数，虾青素缓解饲喂微塑料污染饲料的欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）幼鱼的微塑料蓄积和氧化应激；本研究结果表明牛磺酸补充减弱了SOD、CAT和GSH-PX抗氧化应激相关酶活性的波动幅度，已有研究证实牛磺酸通过直接清除多种自由基和上调包括SOD和CAT的内源性抗氧化酶发挥细胞保护作用，饲料牛磺酸补充可提高多种水生物种抗氧化酶活性并减少ROS产生，此外牛磺酸可能将半胱氨酸导向谷胱甘肽（GSH）生物合成，从而提高细胞内GSH水平，作为关键内源性抗氧化剂，GSH进一步保护细胞免受ROS诱导的氧化损伤；MDA是脂质过氧化的经典终产物，其细胞水平可作为ROS诱导脂质过氧化和组织氧化损伤的可靠间接指标，已有研究记录PS-MPs暴露后鱼和虾中MDA蓄积显著升高，与微塑料胁迫呈正浓度依赖相关，与这些发现一致，本研究中MP暴露泥鳅仔鱼从第7天开始MDA含量显著增加，且该升高状态贯穿整个实验期，这些结果证实PS-MPs诱导持续脂质过氧化，从而引起泥鳅仔鱼组织损伤和细胞毒性，重要的是饲料牛磺酸补充有效逆转了MP诱导的MDA蓄积并减轻脂质过氧化损伤；Keap1-Nrf2信号级联是调控细胞抗氧化响应的关键通路，核因子E2相关因子2（Nrf2）已知结合核内抗氧化响应元件（AREs）并赋予细胞对外源不利刺激的保护，生理稳态下Nrf2与Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）形成复合物，该结合抑制Nrf2功能，外源氧化应激和ROS超载时Nrf2从Keap1解离，随后Nrf2转位入核，与小Maf蛋白形成异二聚体并结合AREs启动下游抗氧化酶基因包括sod、cat和gsh-px的转录，已有证据证实抗氧化剂虾青素通过Nrf2信号通路调节泥鳅抗氧化能力，饲料牛磺酸可激活Nrf2/Keap1通路缓解Megalobrama amblycephala高温诱导的肠道屏障功能损伤；本研究中0.8%以上饲料牛磺酸补充在7天和28天均维持nrf2表达上调和keap1表达下调，通过Keap1-Nrf2信号通路持续激活内源性抗氧化酶表达，在ROS蓄积超过内在抗氧化防御系统清除阈值之前，牛磺酸触发该细胞抗氧化信号级联并促进sod、cat和gsh-px转录，从而增强泥鳅仔鱼对PS-MPs胁迫所致氧化损伤的抵抗力。研究结论部分翻译如下：本研究证明环境相关浓度的聚苯乙烯微塑料显著抑制生长性能、增加死亡率并通过降低泥鳅仔鱼饱食率扰乱摄食行为；微塑料暴露还诱导严重氧化应激损伤，特征为抗氧化酶活性紊乱和MDA过量蓄积；饲料牛磺酸补充有效改善微塑料诱导的生长迟缓、摄食障碍和氧化损伤；值得注意的是，牛磺酸的保护作用不依赖于减少泥鳅仔鱼微塑料摄食，且在0.8%及以上饲料牛磺酸水平下观察到该保护效应，表明牛磺酸通过内源性抗氧化机制发挥保护功能；牛磺酸激活Nrf2/Keap1信号通路，上调下游抗氧化基因表达，提高SOD、CAT和GSH-PX活性，减少MDA蓄积，这些响应有效清除过量活性氧并恢复氧化还原稳态，从而缓解微塑料触发的氧化损伤；总之，适当的牛磺酸补充（≥0.8%）可作为有效饲料添加剂抵抗微塑料胁迫，本研究结果为泥鳅苗种健康养殖和养殖生态系统微塑料污染的生态风险防控提供了理论基础。