《Micromachines》：Three-Dimensional (3D) Bioprinted GelMA/BAMMA Tubular Scaffolds Loaded with Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells: Tissue Remodeling and Vascularization in Rat Omentum
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先天性畸形、医源性损伤及获得性疾病常导致输尿管结构或功能缺损，然而用于输尿管修复与重建的组织工程策略仍十分有限。本研究通过酶消化及甲基丙烯酸酐修饰，由猪膀胱脱细胞基质（BAM）合成光交联型膀胱脱细胞基质（BAMMA）。研究人员对GelMA、GelMA/BAMM
先天性畸形、医源性损伤及获得性疾病常导致输尿管结构或功能缺损，然而用于输尿管修复与重建的组织工程策略仍十分有限。本研究通过酶消化及甲基丙烯酸酐修饰，由猪膀胱脱细胞基质（BAM）合成光交联型膀胱脱细胞基质（BAMMA）。研究人员对GelMA、GelMA/BAMMA及BAMMA水凝胶的力学与生物学性能进行了全面表征，并以GelMA/BAMMA水凝胶与脂肪间充质干细胞（ADSCs）混合物作为生物墨水，制备三维生物打印管状支架，随后将其植入大鼠大网膜内。GelMA/BAMMA复合水凝胶结合了GelMA良好的力学性能与BAMMA的生物活性，支持ADSCs的生长与增殖。大网膜包埋1周后，组织学与免疫组织化学分析显示，与未接种细胞的对照支架相比，接种ADSCs的支架组织重塑增强、新生血管形成增加且局部炎症反应减轻。上述结果表明，负载ADSCs的GelMA/BAMMA生物打印管状支架可在大鼠大网膜模型中发生组织重塑与血管化，为输尿管组织工程提供了一种可行的水凝胶生物墨水，并为未来输尿管修复研究奠定了基础。
研究背景方面，输尿管先天性畸形以及医源性损伤、肿瘤、炎症、创伤和感染等获得性病变均可导致输尿管结构或功能缺损，其中长段（>5 cm）输尿管狭窄及上、中段输尿管缺损的处理是泌尿外科面临的复杂临床难题。目前长段输尿管缺损的手术重建常采用回肠、阑尾、颊黏膜、舌黏膜、膀胱肌瓣及血管等自体组织或器官，但术后常伴随黏液分泌、结石形成、再狭窄、尿路感染及肾功能损害等并发症，因此亟需开发能恢复输尿管解剖结构与生理功能、降低并发症发生率的新型替代方案。基于种子细胞与支架材料的组织工程输尿管为长段输尿管缺损修复提供了有前景的治疗途径，其中脂肪间充质干细胞（ADSCs）因来源广泛、易获取且具备优良的分化与旁分泌能力而成为最常用的种子细胞。支架材料方面，天然生物材料因具有良好的生物降解性与生物相容性以及模拟细胞外基质（ECM）的特性而备受关注，脱细胞基质材料在去除可诱导免疫应答的细胞成分的同时保留了原始组织或器官的ECM结构与组成，有利于细胞黏附、生长、增殖与分化。膀胱与输尿管同源于尿生殖窦，具有相似的尿路上皮衬里与平滑肌层结构，膀胱ECM含有与尿路再生相关的生长因子与细胞因子等组织特异性生物活性因子，因此选择膀胱ECM作为组织特异性ECM来源。甲基丙烯酰化明胶（GelMA）经交联可形成生物相容、可持续且仿生的水凝胶，但其缺乏组织特异性生物学线索，对尿路上皮与平滑肌再生的促进作用有限。三维（3D）生物打印通过逐层打印可精确控制生物材料、生化因子与活细胞在不同层内的空间分布，从而复现靶器官的正常生理结构，已成为器官组织工程的研究热点。本研究旨在制备光交联型膀胱脱细胞基质（BAMMA），全面表征GelMA、BAMMA及GelMA/BAMMA水凝胶的力学与生物学性能，筛选GelMA/BAMMA水凝胶作为生物墨水基质，以GelMA/BAMMA水凝胶与ADSCs混合物为生物墨水，通过3D生物打印制备负载ADSCs的输尿管组织工程管状支架，并将其植入大鼠大网膜，观察支架内组织重塑及周围组织新生血管形成，为输尿管组织工程提供可行的水凝胶生物墨水并为未来输尿管修复研究奠定基础。
研究人员开展的研究及结论与意义方面，研究人员首先由猪膀胱组织经去细胞处理制备BAM，并通过胃蛋白酶消化及甲基丙烯酸酐修饰合成具有光交联性能的BAMMA；随后对GelMA、GelMA/BAMMA及BAMMA三种水凝胶进行系统表征，并基于GelMA/BAMMA水凝胶与ADSCs混合生物墨水，利用挤出式3D生物打印机制备网格支架与管状支架，将管状支架植入大鼠大网膜，1周后通过组织学与免疫组织化学分析评价支架内组织重塑、细胞迁移、血管生成及局部炎症反应。结论表明，合成的BAMMA水凝胶不仅具有快速凝胶特性，还具备良好的生物降解性及促进ADSCs增殖的能力，证明BAMMA合成体系的稳定性；GelMA/BAMMA复合水凝胶结合了GelMA良好的力学性能与BAMMA优良的生物学性能，为输尿管组织工程3D生物打印提供了高性能水凝胶；以GelMA/BAMMA水凝胶与ADSCs混合物为生物墨水成功打印出管状支架，且ADSCs在构建体内分布均匀；3D生物打印管状支架经大网膜包埋后可观察到支架内组织重塑及周围新生血管网络形成。该研究为输尿管组织工程提供了一种可行的水凝胶生物墨水，并为未来输尿管修复研究奠定了基础。
关键技术方法方面，研究人员经去细胞处理制备猪膀胱脱细胞基质（BAM），并采用胃蛋白酶消化与甲基丙烯酸酐修饰合成光交联型BAMMA，通过组织学染色、DNA定量、核磁共振氢谱（1H NMR）及三硝基苯磺酸（TNBS）法评价去细胞效果与甲基丙烯酰化程度；制备GelMA、GelMA/BAMMA及BAMMA水凝胶，通过扫描电子显微镜（SEM）、流变学分析、溶胀率、降解率、压缩与拉伸测试及细胞毒性实验进行表征；以GelMA/BAMMA水凝胶与ADSCs混合物为生物墨水，采用挤出式3D生物打印机制备网格支架与管状支架；将管状支架植入8周龄SD大鼠大网膜，1周后取材进行苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色、DAPI染色及CD31、TNF-α、IL-10免疫组织化学分析。
研究结果方面，3.1 BAMMA的合成：H&E、Masson及DAPI染色显示制备的BAM成功去细胞，表现为细胞核缺失且胶原结构保留；DNA定量显示BAM残留DNA含量（84.20 ± 15.88 ng/mg）显著低于天然膀胱组织（762.30 ± 35.99 ng/mg，p < 0.001）；BAM溶液氨基与甲基丙烯酸酐酸酐基团经酰胺化反应形成酰胺键，赋予BAMMA光交联性能；1H NMR谱显示BAMMA在5.25 ppm与5.53 ppm处出现两个新峰；含0.25%（v/v）LAP的BAMMA溶液经405 nm紫外光照射1 min形成BAMMA水凝胶；TNBS法测得BAMMA甲基丙烯酸酯化率为57.63 ± 9.84%。3.2 GelMA、GelMA/BAMMA及BAMMA水凝胶的表征：大体观察显示GelMA水凝胶透明、BAMMA水凝胶呈白色、GelMA/BAMMA水凝胶不透明偏白；SEM显示GelMA水凝胶多孔结构较BAMMA更明显，GelMA/BAMMA呈中间形态；GelMA（84.12 ± 14.05 μm）与GelMA/BAMMA（73.10 ± 10.07 μm）孔径无统计学差异，但均显著大于BAMMA（47.86 ± 5.73 μm，p < 0.05）；孔隙率方面GelMA（59.97 ± 3.56%）最高，显著高于GelMA/BAMMA（46.55 ± 4.65%）与BAMMA（32.00 ± 1.18%），且GelMA/BAMMA显著高于BAMMA（p < 0.01）；温度扫描显示三组水凝胶均随温度变化发生可逆溶胶-凝胶转变；三组均表现出良好的剪切变稀行为，GelMA/BAMMA黏度居中；溶胀率曲线显示三组48 h达溶胀平衡，48 h时GelMA组（18.71 ± 1.81%）与GelMA/BAMMA组（16.10 ± 1.11%）无显著差异，但显著高于BAMMA组（8.11 ± 1.76%，p < 0.01）；降解率曲线显示三组降解率随时间近乎线性增加，24 h时BAMMA组（86.54 ± 4.31%）几乎完全降解，显著高于GelMA/BAMMA组（65.27 ± 5.99%，p < 0.01）与GelMA组（48.28 ± 5.40%，p < 0.001），GelMA组降解最慢；压缩应力-应变曲线显示GelMA组压缩性能显著优于GelMA/BAMMA组与BAMMA组，GelMA组压缩模量（16.95 ± 0.43 kPa）显著高于GelMA/BAMMA组（5.70 ± 1.67 kPa，p < 0.001）与BAMMA组（1.35 ± 0.64 kPa，p < 0.001），且GelMA/BAMMA组高于BAMMA组（p < 0.01）；拉伸曲线显示GelMA组拉伸性能良好，显著优于GelMA/BAMMA组与BAMMA组，GelMA/BAMMA组（7.11 ± 0.78 kPa）与BAMMA组（4.62 ± 0.73 kPa）杨氏模量显著低于GelMA组（13.62 ± 0.59 kPa，p < 0.001），而GelMA/BAMMA组高于BAMMA组（p < 0.05）。3.3 水凝胶的生物相容性：活/死染色显示ADSCs在三组水凝胶浸提液中均可存活，未见明显细胞死亡；CCK-8实验显示第1天各组OD值无显著差异，第3天对照组与GelMA组无显著差异，GelMA/BAMMA组OD值高于GelMA组（p < 0.05），GelMA/BAMMA组与BAMMA组无显著差异；第5天对照组与GelMA组仍无显著差异，GelMA/BAMMA组OD值显著高于GelMA组（p < 0.001），但显著低于BAMMA组（p < 0.001）。3.4 网格支架与管状支架的3D生物打印：GelMA/BAMMA溶液经3D生物打印机挤出时形成连续细丝；成功打印长1 cm、宽1 cm、高0.5 cm的矩形网格支架；水凝胶可打印因子（Pr）为1.05 ± 0.04（n = 3），接近1，表明打印宏孔接近预设方形几何结构，证实良好的打印形状保真度；打印管状支架时每10层经405 nm紫外光交联15 s，成功制备直径1 cm、长3 cm的管状支架；共聚焦激光扫描显微镜观察显示标记的ADSCs均匀分布于生物打印网格支架与管状支架内。3.5 组织学检查：大网膜包埋1周后，H&E染色显示生物打印管状支架被周围组织完全包裹，层次结构清晰，输尿管腔（UL）位于中央，水凝胶基质（HM）为中间层，最外层为包裹构建体的周围组织（ST）；Masson三色染色显示植入部位胶原沉积，负载ADSCs的实验组胶原纤维较粗且排列相对疏松，而对照组较细且致密；水凝胶基质层内可见细胞浸润与组织重塑，最外层周围组织可见血管样结构；实验组支架内组织重塑面积（9.62 ± 2.04%）显著大于对照组（0.96 ± 0.12%，p < 0.01）；实验组支架内细胞迁移距离百分比（86.42 ± 2.06%）显著优于对照组（14.16 ± 1.54%，p < 0.001）。3.6 免疫组织化学分析：DAPI染色显示对照组水凝胶基质上仅少量细胞分布，而实验组水凝胶基质上可见大量细胞及绿色荧光标记的ADSCs；免疫组织化学染色显示对照组与实验组支架周围组织均可见血管样结构，高倍镜清晰显示血管结构；实验组支架周围组织血管数（36.56 ± 4.22）显著高于对照组（12.78 ± 1.50，p < 0.001）；实验组周围组织CD31阳性面积（2.37 ± 0.42%）亦显著大于对照组（0.58 ± 0.13%，p < 0.01）；TNF-α与IL-10免疫组织化学染色显示，负载ADSCs的GelMA/BAMMA支架组促炎标志物TNF-α表达相对较低，而无细胞GelMA/BAMMA对照组TNF-α免疫反应性较强，相反负载ADSCs组植入物周围抗炎细胞因子IL-10分布更丰富。
讨论部分总结：水凝胶因力学强度、生物相容性、生物降解性及与体内ECM相似性而在组织工程中备受关注，但其用于输尿管组织工程的报道较少。本研究选择BAMMA与GelMA两种水凝胶混合物作为管状支架材料，BAM优先于其他脱细胞基质是因为膀胱与输尿管具有同源尿路组织学特征，保留了对输尿管再生更有利的尿路特异性生物活性线索；BAM经胃蛋白酶消化产生暴露氨基的肽片段，再经甲基丙烯酸酐修饰形成酰胺键，合成具有快速光交联性能的BAMMA。所采用的商品化GelMA甲基丙烯酰化度为60 ± 5%，而BAMMA由异质性肽片段组成、无均匀重复序列，无法通过1H NMR准确计算甲基丙烯酰化度，故采用TNBS法评估其修饰水平，三批初步BAMMA经TNBS表征平均甲基丙烯酰化度约57.63%，鉴于ECM源性材料存在批间差异，每批BAMMA常规检测甲基丙烯酰化度，仅50%至70%的批次用于下游实验以稳定理化与生物学性能。组织学染色、DNA定量、1H NMR及TNBS实验证实BAM成功去细胞与甲基丙烯酰化；BAMMA具有良好细胞相容性及促进ADSC增殖能力，归因于胃蛋白酶消化与甲基丙烯酰化过程中保留的血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子-BB及角质细胞生长因子等生物活性ECM成分；BAMMA快速生物降解性有利于快速组织整合但不利于长期结构支撑，且单纯BAMMA水凝胶储物模量低、抗压性弱、延展性差，不足以在挤出过程中保持形状保真度。GelMA提供互补的力学增强，包括更高储物模量、改善的打印性及增强的结构稳定性，同时保持细胞相容性。BAMMA（提供组织特异性生物活性与生长因子保留）与GelMA（提供力学支撑与打印性）的组合旨在实现兼顾3D生物打印管状支架生物学与力学需求的协同生物墨水系统。GelMA/BAMMA复合材料的互连孔网络为氧气、二氧化碳及营养物质交换提供必要通道；GelMA/BAMMA组平均孔径小于纯GelMA组，归因于BAMMA由异质性刚性ECM片段组成，具有丰富的氢键与静电吸引等物理链间相互作用，在共价光交联前诱导BAMMA域早期预聚集，调节液-液相分离动力学并限制凝胶化与冷冻干燥过程中富水成孔域的尺寸，尽管孔径减小，复合水凝胶仍保持有利于细胞迁移与营养扩散的互连孔隙率；早期微聚集仅形成孤立离散域而非长程连续网络，纯BAMMA光固化后无法在这些分离聚集体间建立渗透性共价骨架，导致富含结构缺陷的松散不连续交联架构，进而造成其快速降解与较差力学性能；加入GelMA后储物模量与力学强度大幅提高，满足挤出式生物打印的打印性与结构稳定性要求；GelMA/BAMMA复合物较纯BAMMA降解慢是刻意设计考量，延长降解曲线为组织再生提供更长时间窗口并维持结构支撑，对输尿管组织工程中支架需在初始愈合阶段维持管腔通畅尤为重要，但体内降解行为受酶活性、力学负荷、细胞重塑及免疫介导降解等多因素影响，可能与体外酶降解结果存在差异，尚待未来植入研究验证；GelMA/BAMMA复合材料保持的生物相容性及支持ADSC增殖能力证实共混策略成功保留BAMMA生物学优势同时获得必要力学性能。3D打印通过逐层打印可精确控制生物材料、生化因子与活细胞在不同层内的空间定位，从而模拟靶器官正常生理结构；挤出式3D生物打印的打印保真度高度依赖水凝胶生物墨水的流变学性能，GelMA/BAMMA水凝胶的剪切变稀与热敏性能是其打印性的关键决定因素，剪切变稀降低喷嘴内剪切应力下材料黏度、便于顺利挤出并最大限度减少对包裹细胞的损伤，剪切应力去除后黏度快速恢复从而有效维持打印构建体形态、防止结构坍塌与铺展，热敏性能实现温度诱导的溶胶-凝胶相变，使水凝胶在打印过程中保持良好流动性并在沉积后冷却时快速固化，从而最大化3D打印构建体的结构稳定性；共聚焦显微镜证实ADSCs在管状支架内均匀分布，进一步表明生物打印过程未损害细胞活力或空间分布。打印管状支架时研究人员尝试制备长段（>5 cm）构建体，当打印高度超过3 cm时整个管状支架开始晃动甚至倾斜，可能原因是缺乏内部支撑使中空管状支架随打印高度增加而不稳定；尽管存在长度限制，3D生物打印因对多层结构的精确空间控制及均匀细胞分布仍是输尿管组织工程的有前景方法，未来可通过优化打印参数、生物墨水配方及打印策略克服长度限制，研究人员正尝试采用悬浮打印解决该问题。组织工程支架植入体内后其生存环境由体外培养基环境转变为体内组织液环境，需快速建立血液循环为种子细胞提供营养与氧气以维持其存活与后续功能发挥，因此快速血管化是组织工程修复与重建的关键步骤，直接决定再生结局的成功；本研究中接种ADSCs的管状支架较未接种者组织重塑与血管化显著增强，可归因于多种协同机制：GelMA/BAMMA水凝胶内残留生物活性因子 contributed to the pro-angiogenic effect，ADSCs可通过分化为内皮细胞及周细胞样细胞直接参与新生血管形成，也可通过分泌促血管生成生长因子与细胞外囊泡间接促进新生血管形成，因此ADSCs可能通过多条途径促进生物打印管状支架周围组织血管生成；除水凝胶内在生物活性及ADSCs旁分泌与分化效应外，大网膜作为高度血管化组织通过丰富的生长因子、细胞因子及祖细胞供应为新生血管形成提供有利微环境；研究人员既往研究证实将组织工程支架包埋于大网膜可增强血管反应，但本研究中仅在生物打印支架周围宿主组织检测到强烈血管生成，而未观察到水凝胶基质内明显血管长入，此现象可能归因于大网膜孵育时间有限或缺乏引导支架基质内有序血管再生的预定义通道；总体而言，组织特异性GelMA/BAMMA水凝胶、ADSC递送及大网膜孵育发挥联合促血管生成效应，支持支架周围组织血管结构形成。尽管BAMMA来源于异种猪膀胱脱细胞基质，植入后未检测到明显免疫排斥与严重异物反应，此良好免疫特征主要归因于去细胞过程大幅去除细胞抗原并极大减轻原材料ECM组织的固有免疫原性，此外水凝胶内包裹的ADSCs进一步调节局部炎症微环境，与TNF-α及IL-10免疫组织化学染色显示负载ADSCs组较无细胞对照组炎症反应更轻相一致，支持ADSCs的免疫调节能力；实验组观察到细胞与组织迁移进入植入水凝胶支架，但所检测时间点水凝胶基质内未形成成熟血管通道；Masson三色染色进一步显示负载ADSCs构建体周围环绕较厚且排列疏松的胶原纤维；总体这些发现表明负载ADSCs的GelMA/BAMMA水凝胶支架在大网膜孵育后保留促进组织重塑的能力。值得注意的是，大网膜孵育对输尿管重建设计具有额外战略意义，此大网膜孵育作为后续输尿管重建的预血管化准备步骤，得益于其良好活动性，大网膜包裹的构建体将直接用于输尿管替代而无需将支架与大网膜分离，此分期包埋与移植方法具有临床可行性，保留的大网膜作为血管蒂在转移至输尿管缺损后维持移植物灌注。本研究局限性包括：虽成功用3D生物打印机与GelMA/BAMMA水凝胶打印管状支架，但打印支架长度仅3 cm，未能实现长段（>5 cm）管状支架；虽对GelMA/BAMMA水凝胶进行了体外生物降解实验，但支架降解与组织再生间的动态平衡是评价水凝胶材料的关键指标，本研究未开展管状支架体内生物降解研究；此外本研究仅完成管状支架的3D生物打印与大网膜包埋，未进行输尿管损伤后的原位修复与重建实验；未来研究将聚焦解决上述问题，旨在实现管状支架长段3D生物打印、开展管状支架体内生物降解研究、进一步改进3D生物打印所需生物墨水材料，并完成生物打印管状支架修复与重建输尿管缺损的体内实验，从而全面评价生物打印管状支架修复与重建输尿管缺损的疗效。
结论部分翻译：本研究合成的BAMMA水凝胶不仅表现出快速凝胶特性，还具备良好的生物降解性及促进ADSCs增殖的能力，证明BAMMA合成体系的稳定性。此外，由GelMA与BAMMA充分混合制备的GelMA/BAMMA复合水凝胶结合了GelMA良好的力学性能与BAMMA优良的生物学性能，为输尿管组织工程3D生物打印提供了高性能水凝胶。以GelMA/BAMMA水凝胶与ADSCs混合物为生物墨水，通过3D生物打印机成功打印出管状支架，并观察到ADSCs在构建体内均匀分布。随后将3D生物打印管状支架包埋于大网膜，可观察到支架内组织重塑及周围新生血管网络形成。
