基于树状DNA坐标条形码的FFPE组织适配空间RNA测序实现存档组织单细胞分辨率高灵敏全转录组空间分析

《SCIENCE ADVANCES》：Decoder-FFPE-seq enables sensitive, genome-wide spatial transcriptomics of archival tissues at single-cell resolution

与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织兼容的空间转录组学（ST）正在变革生物学与组织病理学，但实现高灵敏度、全转录组覆盖、单细胞分辨率以及研究人员可及性仍具挑战。为应对这些挑战，研究人员提出了一种用于FFPE组织适配空间RNA测序的树状DNA坐标条形码设计（Decoder-FFPE-seq），其通过将RNA-to-DNA探针转换与印迹辅助条形码化相结合。Decoder-FFPE-seq在全转录组小鼠脑及存档人类样本分析中较现有平台提供单细胞分辨率且灵敏度提升>2.6倍，可解析低丰度基因的潜在细胞身份、更精细的组织结构，并捕获具有预后价值的上皮-间质转化相关特征。借助扩展的探针文库，Decoder-FFPE-seq可捕获长链非编码RNA和病毒RNA，揭示其与信使RNA在口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的空间共调控网络。在一个OSCC免疫治疗队列中，分别在化疗免疫治疗前和治疗后样本中鉴定出两个CD8⁺ T细胞亚群，可能与治疗应答相关。Decoder-FFPE-seq为基础与转化研究中存档组织的灵敏ST分析建立了一个稳健、高分辨率且易获取的框架。

**研究背景与问题**

空间转录组学（ST）能够在天然组织语境中揭示细胞架构与分子网络，推动生物学、器官发生及疾病病理学认识。在肿瘤学中，ST为解构肿瘤微环境（TME）提供了前所未有的分辨率，揭示其细胞组成、空间组织与相互作用，阐明肿瘤发生、进展及治疗耐药的分子机制。将这些认识转化为临床实践需要与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本兼容的ST平台，而FFPE是病理档案的基础。这些庞大的样本库为将空间分子图景与标注的临床结局相关联提供了无可比拟的机会，从而推动精准肿瘤学。然而，FFPE样本中的RNA在固定和长期储存过程中会发生交联、片段化和降解，这些改变导致poly(A)尾丢失以及核酸与生物分子之间形成加合物，削弱基于poly(T)的RNA捕获和酶促反应，阻碍ST在存档样本中的应用。

有效的FFPE样本ST分析需要四项关键能力：（i）特异性回收全转录组转录本，涵盖mRNA、调控RNA甚至病原RNA，同时排除基因组DNA和高度丰富（约80%）但信息有限的核糖体RNA（rRNA）的干扰；（ii）灵敏检测存档组织中低丰度或严重降解的转录本，以识别生物标志物和稀有细胞类型；（iii）单细胞分辨率以解析结构细节和细胞间相互作用；（iv）可及性、可采用性和可重复性，以便在研究界广泛使用并适用于大规模纵向队列研究。尽管已有若干先驱性探索，满足这些要求的FFPE兼容ST方法仍然有限。

基于成像的ST方法如多重荧光原位杂交（FISH）/测序平台在FFPE组织中实现了亚细胞分辨率和高灵敏度，但其有限通量、劳动密集的工作流程和成像信号漂移阻碍了全转录组可扩展性。基于阵列的ST平台，包括10x Genomics的Visium CytAssist_FFPE和Visium HD，以及Stereo-seq V2和Patho-DBiT等新兴方法，通过实现全转录组原位捕获和空间条形码化绕过了成像系统的通量上限。然而，每种方法都保留固有局限：Visium仅提供mRNA分析，灵敏度中等且用户被锁定于闭源试剂盒；Stereo-seq V2和Patho-DBiT虽覆盖总RNA，但使用随机引物或原位多聚腺苷酸化导致基因组DNA和rRNA的混杂捕获，损害了其灵敏度和特异性，尤其对低丰度和严重降解转录本的检测；此外，Patho-DBiT受组织变形和微通道交叉污染风险困扰，Stereo-seq V2需要复杂的位置解码，均限制了可及性。

研究人员此前开发了Decoder-seq，使用含有高密度确定性空间条形码的树状DNA玻片（Decoder玻片）对新鲜冷冻（FF）组织进行高灵敏ST分析。本文报道了FFPE组织适配的Decoder-seq（Decoder-FFPE-seq），其将RNA片段转化为可编码和可扩增的DNA探针，并利用高条形码密度Decoder玻片上的印迹辅助空间条形码化。Decoder-FFPE-seq整合了若干关键进展，以广泛可及的方式实现存档组织的灵敏、高分辨率、全转录组分析。第一，拓宽了ST范围以纳入更广泛的RNA种类；设计了多个分裂探针文库用于特异性且无偏地回收全mRNA、关键调控长链非编码RNA（lncRNA）和病原RNA，有效最小化DNA和rRNA的非特异性捕获。第二，在Decoder玻片上实施印迹辅助空间条形码化以显著提高基因检测灵敏度；该策略将组织预处理和探针标记分离于独立玻片，从而防止条形码DNA丢失和潜在污染，并充分利用Decoder玻片的高条形码容量。第三，进一步提高Decoder玻片的空间分辨率，使Decoder-FFPE-seq实现单细胞分辨率（8-μm斑点）。第四，建立了易于遵循的工作流程及详细方案，涵盖组织预处理、探针靶向和印迹辅助空间条形码化，以最大化RNA回收同时确保可重复性和可及性。结合Decoder玻片的公开制备工艺，Decoder-FFPE-seq确保了在研究界的广泛可及性和可采用性。

**主要技术方法**

研究人员采用的核心技术方法包括：（1）分裂探针（split-probe）设计，将RNA片段转化为可编码和可扩增的DNA探针，每个转录本由一个或多个相邻位点杂交的左探针（携带PCR handle Read 2和25-nt靶向序列）与右探针（含5'磷酸化25-nt靶向序列和poly(A)尾）组成，仅正确配对的相邻探针被连接；（2）印迹辅助空间条形码化（blotting-assisted spatial barcoding），将连接后的探针转移至Decoder玻片进行空间条形码化，组织切片附着于传统玻片而非Decoder玻片以避免高温处理导致的条形码DNA丢失；（3）微流控辅助组合条形码化制备8-μm斑点Decoder玻片（36,864个条形码斑点）；（4）定制探针印迹仪器（含组织玻片模块、条形码阵列玻片模块、温控模块、成像模块、升降模块和位置对齐模块）实现精确对齐。样本队列来源：小鼠脑组织（雄性C57BL/6J小鼠，6-8周龄）；临床FFPE样本来自上海交通大学医学院附属仁济医院病理科（伦理批件KY2023-013-B）和武汉大学口腔医学院及医院（伦理批件WDKQ2025.B42、[2020]伦理第2号），包括10例存档OSCC样本（含1例HPV阳性）、7例ICB治疗患者的12个FFPE标本块（来自NCT04649476随机二期试验的68例入组者亚组）以及乳腺癌和淋巴结样本。

**研究结果**

**Decoder-FFPE-seq工作流程**：Decoder-FFPE-seq包括三个主要步骤：RNA-to-DNA探针转换、印迹辅助空间条形码化和测序及生物信息学分析。优化的方案结合覆盖整个小鼠蛋白质编码转录组的21,178个分裂探针对，在50-μm斑点中检测到约19,297个独特基因，中位60,466个UMI和9,960个基因/斑点（约40%测序饱和度）。Decoder-FFPE-seq较对照处理条件展现基因检测灵敏度的实质性提升，甚至优于已发表的FF MOB Decoder-seq数据。蛋白质编码基因计数在Decoder-FFPE-seq和Decoder-seq数据集间高度一致（R=0.88），层特异性标记基因空间分布一致。无监督聚类揭示的簇空间分布忠实再现了分层MOB结构。

**Decoder-FFPE-seq的评估与基准测试**：50-μm斑点Decoder-FFPE-seq在小鼠脑分析中每斑点检测中位29,907个UMI和7,571个基因，优于Visium CytAssist_FFPE和Patho-DBiT。测序深度归一化后仍显示优越灵敏度。重复间可重复性高（R=0.99）。为 enabling 高清晰度空间映射，研究人员将Decoder-FFPE-seq推进至单细胞分辨率，制备含36,864个条形码斑点的8-μm斑点Decoder玻片。8-μm斑点Decoder-FFPE-seq维持优越检测灵敏度，每8-μm斑点中位722个UMI和617个基因，显著优于Stereo-seq V2（10-μm bin：429 UMI和232基因）和Visium HD（8-μm bin：156 UMI和145基因）。按单位条形码面积归一化后，Decoder-FFPE-seq较两种方法实现2.63至4.63倍更高的基因检测灵敏度。空间准确性评估显示，海马CA1区域三个区域富集基因的FWHM值与H&E染色观察到的CA1区域实际宽度密切匹配，证实扩散控制良好。

**Decoder-FFPE-seq以单细胞分辨率高灵敏准确分析小鼠脑**：8-μm斑点Decoder-FFPE-seq检测到340个非感觉GPCR，每平方微米UMI计数显著高于Visium HD和Stereo-seq V2。非感觉GPCR表达谱与高灵敏度MERFISH数据的相关性更强（R=0.90）。Gpr83在皮层和海马区域富集，与MERFISH数据一致。Gpr83⁺斑点显示Neurod6、Adra1d和Pvalb上调及Mbp、Mobp和Apoe下调，指示神经元和抑制性中间神经元特征伴胶质特征减少。空间共定位分析表明Gpr83与抑制性中间神经元标记物Gad1、Gad2、Reln和Pvalb共定位，支持其与GABA能中间神经元的广泛关联，而Stereo-seq V2和Visium HD未检测到该共定位。使用snRNA-seq参考进行细胞类型解卷积，82.5%斑点被分配至单一细胞类型，确认单细胞分辨率；鉴定50种细胞类型，空间分布与空间簇密切对应，重建六层皮层和海马亚区等经典脑架构，稀有抑制性神经元亚型如Lamp5、Vip和Sst中间神经元也被有效解析。

**Decoder-FFPE-seq表征存档临床组织中与临床结局相关的TME异质性**：在FFPE乳腺癌切片中，50-μm斑点Decoder-FFPE-seq在每斑点UMI和基因计数上优于55-μm斑点Visium CytAssist_FFPE，其在乳腺癌和淋巴结FFPE组织中的灵敏度甚至超过Visium对FF样本的表现。探针多重性从平均每转录本一对增至三对，将淋巴结检测从30,140 UMI/7,770基因每斑点提升至103,501 UMI/12,971基因。在6年OSCC FFPE样本中每斑点检测中位10,625 UMI和3,951基因。扩展至8至20年存档OSCC标本，即使在严重RNA降解（DV200=17%）的20年样本中仍一致检测每斑点中位超过4,000基因，空间簇与H&E标注病理区域密切匹配。在20年OSCC样本中，簇14定位于坏死肿瘤区域显示巨噬细胞分布，簇2、5、6和8局限于淋巴细胞(+)基质区域，准确解析CD4⁺/CD8⁺ T细胞和B细胞等多样免疫群体。低丰度免疫检查点基因包括PDCD1、HAVCR2、CD274和LGALS9也被有效检测。在6年OSCC伴淋巴结转移标本中，Decoder-FFPE-seq展示CD163⁺巨噬细胞与FAP⁺癌症相关成纤维细胞（CAF）在肿瘤-基质界面的空间共定位，经多重免疫荧光验证。8-μm斑点Decoder-FFPE-seq在包含中度异型增生上皮、基质和基质浸润性肿瘤的存档OSCC样本中较Visium HD每斑点UMI检测增加8.9倍、基因计数增加7.5倍，鉴定34个不同簇（Visium HD为28个），将基质浸润性肿瘤解析为两个不同簇（簇32和6）并在异型增生-基质界面识别连续层状簇（簇3）。差异表达和GO富集分析显示Decoder-FFPE-seq鉴定更多数量和比例的DEG及更显著富集通路。细胞类型解卷积表征异型增生上皮、界面、基质和基质浸润性肿瘤的细胞组成，界面显示高比例肿瘤细胞、内皮细胞、肌成纤维细胞、CD4⁺/CD8⁺ Tn细胞和CD8⁺ EarlyActive细胞，而基质浸润性肿瘤区域显示免疫浸润显著增加。PROGENy通路分析揭示EGFR通路沿空间轴呈V形活性模式，伴随EMT相关TGF-β信号逐渐增加。细胞-细胞相互作用揭示界面处肿瘤细胞与CAF主要通过MIF–(CD74+CD44)和COL1A1-SDC1轴相互作用，而基质浸润性肿瘤区域CAF-肿瘤相互作用进一步分化。通过单变量Cox、LASSO和多变量Cox分析鉴定18个关键基因，空间投影确认基因集在簇32基质浸润性肿瘤区域富集，功能富集分析显示其与EMT显著相关（P=0.02），在TCGA-HNSC、CESC和ESCA队列中有效将患者分层为高风险和低风险组。

**扩展ST至非poly(A)尾和非宿主RNA检测**：研究人员设计靶向275个OSCC相关lncRNA的探针面板，Decoder-FFPE-seq检测到全部275个靶标，每50-μm斑点中位3,358 UMI和114基因。代表性lncRNA（H19、NEAT1和MALAT1）空间分布与金标准smFISH在相邻OSCC切片中测量结果一致，相关系数超过0.50，Decoder-FFPE-seq回收smFISH检测数量的92.0±17.1%。使用mRNA-lncRNA联合面板，无监督聚类鉴定11个空间组织簇，对应病理标注的肿瘤、基质和肿瘤相关炎症区域。相对lncRNA表达在肿瘤相关炎症区域显著富集。共表达网络分析鉴定43个空间模块，SM15定位于肿瘤相关炎症区域，含致癌lncRNA NEAT1、炎症介质CXCL8和CCL20及氧化应激调节因子FTH1和SOD2等枢纽基因，功能富集确认SM15与TNFα–NF-κB、炎症反应和IL-6/JAK/STAT3等炎症通路强相关。TNFα–NF-κB通路的空间投影与NEAT1表达重叠，相关系数为0.63。空间共表达网络分析揭示NEAT1与炎症相关基因（IL1B和CXCL8）及细胞周期调节因子G0S2的最高拓扑相似性，显示空间共定位。设计HPV16/18特异性E6/E7探针在HPV阳性OSCC样本中共分析宿主转录组和病毒E6/E7转录本，E6/E7空间表达局限于肿瘤区域，UMI计数与FISH测量强相关（R=0.88）。E2F靶标及其下游组蛋白和细胞周期相关基因（HIST1H3G、HIST1H2BG和MKI67）与E6/E7转录本丰度正相关。

**Decoder-FFPE-seq识别OSCC免疫治疗后病理应答相关空间生态位**：应用50-μm斑点Decoder-FFPE-seq于7例接受新辅助抗PD-1临床试验的局部晚期OSCC患者治疗后FFPE标本，样本分类为主要病理应答（MPR；n=3）、病理部分应答（pPR；n=2）和病理无应答（pNR；n=2）。细胞类型解卷积和无监督聚类解析10个主要细胞类型生态位（CN），每个CN显示独特细胞类型组成和空间分布，大体与病理定义区域一致。MPR肿瘤富集混合肿瘤-上皮CN 3，pPR肿瘤以CN 6为主，pNR肿瘤主要含肿瘤富集CN 8和9。基因集富集确认生态位特异性功能程序：MPR肿瘤中CN 3显示降低的恶性潜能、低增殖活性和显著减弱的EMT特征；pPR肿瘤中CN 6表现升高的效应T细胞运输、Th1细胞信号和抗肿瘤细胞因子表达；pNR主导的CN 8显示升高的促肿瘤细胞因子和降低的抗肿瘤细胞因子，CN 9以强Treg细胞特征为标志。

**Decoder-FFPE-seq解码化疗免疫治疗前后OSCC空间细胞动态**：对OSCC患者治疗前活检标本测序并与匹配治疗后数据整合，配对空间分析限于接受相同治疗（化疗免疫治疗；MPR和pNR-1组）的患者。通路分析揭示组间显著空间转录异质性：化疗免疫治疗后，MPR患者中同种异体移植排斥和IL-2/STAT5信号通路在T-M和M-P区域强烈上调，而pNR-1中这些通路下调，反而持续富集TGF-β信号和增殖程序。基线时MPR患者在M-P区域显示强免疫细胞浸润，而pNR-1样本显示髓系主导的微环境。治疗后MPR患者该区域免疫细胞进一步富集，巨噬细胞、DC和CD8⁺ EarlyActive细胞在T-M升高；pNR-1则显示CD8⁺ Tex细胞、CD8⁺/CD4⁺ Tn细胞、DC、CD8⁺ Tem细胞、Th1细胞、Treg细胞和巨噬细胞在M-P区域增加。应用8-μm斑点Decoder-FFPE-seq与Xenium基准比较，确认其在临床组织细胞分辨率分析中的灵敏度和准确性。CD8⁺ EarlyActive在post–MPR-1扩增，而CD8⁺ Tex细胞在post–pNR-1增加。细胞-细胞通讯分析确认其空间相互作用：MPR-1中CD8⁺ EarlyActive通过SEMA4D-PLXNB2、SELPLG-SELL和CCL5-CCR5、CCL19-CCR7、CCL5-CCR4等配体-受体对与B细胞和Th1细胞强相互作用；pNR-1则以CD8⁺耗竭T细胞与CAF通过FN1-CD44、COL1A1-CD44和COL1A2-SDC4相互作用为主，反映CAF主导的免疫抑制微环境。

**讨论与结论**

讨论部分指出，ST已转变研究人员在原始组织语境中映射分子和细胞组织的能力，但大多数ST方法依赖高RNA完整性（RIN>7），因此主要限于FF材料，而FFPE样本库在室温下可稳定数十年并与丰富临床元数据关联，但其重度交联和片段化RNA限制了ST采用。现有FFPE兼容ST方法在通量、灵敏度、空间分辨率和可及性之间被迫权衡。Decoder-FFPE-seq通过整合特异性RNA-DNA探针转换、高效印迹辅助空间条形码化和高通量测序为标准化开放工作流程来解决这些限制，使存档组织的灵敏、全转录组空间分析在单细胞分辨率下可用常见实验室设备和试剂实现。分裂探针设计靶向每个转录本一个或多个非poly(A)区域，以高特异性和效率将短RNA片段转化为可扩增DNA探针，同时最小化DNA和丰富低信息rRNA的捕获。与印迹到纳米结构Decoder玻片（提供约10倍高于可比阵列的条形码密度）相结合，该方法防止 harsh FFPE预处理期间的条形码丢失并最大化探针与空间条形码之间的有效相遇。Decoder-FFPE-seq将ST扩展至非poly(A)尾调控RNA和非宿主转录本，使用定制探针面板联合分析mRNA、OSCC相关lncRNA和HPV E6/E7转录本，揭示空间共表达模块如SM15中NEAT1作为网络枢纽与炎症介质和氧化应激基因关联。Decoder-FFPE-seq提供可及平台降低技术壁垒，使用微流控辅助组合条形码化策略可在标准实验室环境按照既定方案成本有效地制备Decoder玻片，规避了Stereo-seq V2中基于测序解码的实质技术障碍和Visium HD所需的光导向合成。Decoder-FFPE-seq释放存档FFPE收藏用于临床和转化研究的巨大潜力，在20年临床样本中实现空间分析，成功回收高度片段化RNA（DV200=17%）以识别组织结构和免疫群体，较Visium HD灵敏度提高8.9倍，鉴定更多DEG和富集通路， refined 异型增生-基质界面和基质浸润性肿瘤异质性表征，产生在HNSC、CESC和ESCA中具有预后价值的EMT相关基因特征。在ICB治疗试验队列中，Decoder-FFPE-seq解析应答依赖的TME异质性并追踪化疗免疫治疗差异应答的空间细胞动态。

研究结论：Decoder-FFPE-seq建立了一个灵敏、全转录组、单细胞分辨率和广泛可及的空间生物学研究ST框架。展望未来，若干改进可进一步增强其能力：灵敏度可通过改进探针释放和界面条形码化效率提高，如电泳探针释放或DNA纳米工程方法优化条形码密度和方向；亚细胞分辨率可通过整合高分辨率条形码玻片（如纳米图案化阵列）或膨胀显微镜至印迹辅助工作流程实现；扩展探针设计纳入额外靶标如microRNA、其他ncRNA（如环状RNA）和非宿主转录本，或应用总转录组策略将拓宽分子覆盖；超越转录组学，Decoder-FFPE-seq具有通过整合蛋白质组学或表观基因组学标记方法实现空间多组学的潜力；临床上，将该方法扩展至大型患者队列并将结果与人工智能框架耦合将促进生物标志物、治疗靶点和预测模型的发现。这些进展共同将Decoder-FFPE-seq定位为生物研究和精准医学中下一代空间组学的多功能基础。