编辑推荐：
出芽式血管生成（sprouting angiogenesis）对胚胎发育、伤口愈合和肿瘤生长至关重要。本研究表明，近来被用于研究多种形态发生事件的液晶框架为血管出芽生成提供了独特见解。在血管内皮生长因子（VEGF）——一种强效促血管生成因子——的刺激下，培养于
出芽式血管生成（sprouting angiogenesis）对胚胎发育、伤口愈合和肿瘤生长至关重要。本研究表明，近来被用于研究多种形态发生事件的液晶框架为血管出芽生成提供了独特见解。在血管内皮生长因子（VEGF）——一种强效促血管生成因子——的刺激下，培养于软胶原水凝胶表面的内皮细胞（ECs）形成伸长的细胞流，并与较多边形的细胞区域共存。血管出芽生成优先起始于细胞流尖端，该处向列相序梯度最为显著。研究证明，细胞流与导致下方水凝胶发生三维形变的大牵引力相关，且细胞流的形成源于微管（MT）聚合与肌动球蛋白收缩性之间的精细平衡。最后，研究表明主动控制向列相序可调控出芽形成，突显了内皮细胞取向梯度在血管出芽生成中的关键作用，并为新的治疗途径开辟了道路。
研究背景方面，出芽式血管生成是指从已有血管形成新微血管的过程，对胚胎发育、伤口愈合及缺血后组织再灌注至关重要，同时在肿瘤发展等疾病中发挥重要作用。过去数十年的研究已对调控出芽起始和生长的信号通路提供了深入认识，近年来机械力在血管出芽生成中的作用日益受到重视，但关于生物物理因素在出芽形成中作用的文献存在相互矛盾的报道，其潜在机制在很大程度上仍不清楚。血管出芽生成的初始阶段涉及从二维（2D）到三维（3D）的转变，即毛细血管分支从平面内皮单层中伸出并生长进入下方细胞外基质。这一过程与其他形态发生事件相似，后者近来在活性液晶框架内得到了解释，包括上皮细胞挤出、成肌细胞丘状形成、成肌细胞交叉双层化以及水螅形态发生等。这些过程的共同特征似乎是向列相排列构型中的局部畸变作为新兴形态特征的起始点。VEGF作为一种强效促血管生成激动剂，已被证明可诱导内皮细胞（EC）形态的显著变化。体外研究表明，VEGF可引起部分EC的明显伸长，导致形成具有向列相排列的纺锤状细胞流，其周围环绕着伸长程度较低的细胞斑块。这种向列相畴与更各向同性区域共存的情形在形态发生文献中尚无先例。本研究旨在确定EC活性与VEGF诱导的向列相EC排列畸变之间的相互作用如何影响血管出芽起始。为此，研究人员开发了一系列体外系统，将EC培养至汇合状态于软胶原水凝胶表面，随后监测VEGF刺激下血管出芽向水凝胶内的发展。该研究发表在《SCIENCE ADVANCES》。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：（1）建立了平面单层-水凝胶出芽实验平台，将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养于纤连蛋白包被的I型胶原水凝胶表面；（2）牵引力显微镜（TFM）技术，通过在水凝胶中嵌入荧光聚苯乙烯微球测量细胞牵引力；（3）活性向列相理论建模，基于对称性论证计算向列相牵引力密度并与实验对比；（4）胶原水凝胶表面微图案化技术，包括粘附/非粘附条纹图案和拓扑表面图案；（5）芯片微血管系统，通过压力诱导周向拉伸研究三维环境下的出芽行为；（6）光学相干断层扫描（OCT）和线场共聚焦光学相干断层扫描（LC-OCT）用于水凝胶表面形貌测量。HUVECs来源于ScienCell Research Laboratories和Lonza。
研究结果方面，第一，VEGF在体外同时诱导血管出芽和内皮形态变化。研究人员将HUVECs培养至汇合于纤连蛋白包被的I型胶原水凝胶表面，通过参数研究确定了VEGF（50 ng/ml，66小时）为同时稳健引发出芽和显著形态变化的条件。在此条件下，出芽密度为2.0 ± 1.2 sprouts/mm2，对照组几乎无出芽。VEGF诱导部分细胞显著伸长，使平均逆纵横比从0.63 ± 0.02降至0.40 ± 0.01，形成高度伸长且排列的细胞流，周围环绕伸长程度较低的“多边形”细胞区域。VEGFR抑制剂SU5416实验表明阻断VEGFR可消除VEGF诱导的细胞流形成并抑制出芽形成。
第二，新生出芽与楔形区域共定位。出芽通常沿细胞流边界出现。研究人员识别了细胞流边界上细胞垂直于边界排列的特定区域，命名为“楔形区域”（wedges）。通过距离图分析比较出芽到楔形区域的距离分布与细胞流和多边形细胞区域的距离分布，揭示了出芽与楔形区域的共定位，表明楔形区域而非细胞流整体是血管出芽生成的优先位点。
第三，楔形区域代表特殊的力学环境。研究人员分析了对照组和VEGF处理组EC的取向序，发现向列相序在所有尺度上占主导。基于活性向列相理论，计算了三种具有向列相对称性的力密度：模量项、展曲项和弯曲项。结果表明，对照组牵引力模式基本均匀，而VEGF处理组中牵引力幅度在楔形区域附近达到峰值。TFM实验证实了该预测，显示楔形区域牵引力幅度峰值，力主要指向细胞流主体方向，且与线性弹性半无限区域模型的平面内位移场一致。
第四，VEGF诱导基底起皱。研究人员使用线性弹性半无限区域模型预测楔形区域胶原表面存在面外位移。共聚焦显微镜观察发现VEGF处理组胶原表面出现皱纹（景观中的谷底），优先定位于细胞流下方。OCT定量确认VEGF组皱纹深度（8.9 ± 2.1 μm）较对照组（4.1 ± 0.7 μm）增加。但实验观察与理论预测存在两方面差异：皱纹沿整个细胞流延伸而非仅局限于楔形区域；面外位移与面内位移量级相当而非显著较小。
第五，差异基质降解而非沉积 contributed to 皱纹形成。OCT成像确认基底起皱需要EC单层的存在。基底膜（BM）蛋白（层粘连蛋白、IV型胶原和纤连蛋白）厚度在皱纹和非皱纹区域间无差异，表明差异基质沉积不参与皱纹形成。MT1-MMP在细胞流区域密度较高，但广谱MMP抑制剂Ilomastat对皱纹深度无影响，且MT1-MMP表达差异小于5%，表明差异基质降解是皱纹形成的次要因素。
第六，VEGF诱导细胞骨架组织和细胞间连接的变化。研究人员探讨了细胞流内伸长细胞与流外多边形细胞之间的细胞内组织差异。对照组中肌动蛋白和微管结构基本各向同性，微管围绕中心MTOC呈放射状组织，肌动蛋白形成星状应力纤维连接相邻细胞。VEGF处理诱导细胞流内微管和肌动蛋白排列，微管围绕MTOC组织成两个直径相对的束，长肌动蛋白应力纤维伴随皮质肌动蛋白增加。多边形细胞区域中微管和肌动蛋白应力纤维分布更分散，恢复类似对照组的组织。连接形态方面，多边形细胞 exhibit 更不规则和锯齿状的VE-钙黏蛋白分布，而细胞流中伸长细胞 exhibit 连续、线性、光滑的“拉链样”连接以及钙黏蛋白斑块。
第七，细胞流形成和皱纹深度受MT聚合与肌动球蛋白收缩性之间平衡的调控。研究人员调查了细胞骨架改变药物对细胞流和基底皱纹形成的影响。nocodazole和taxol均导致细胞伸长显著丧失，calyculin A增加收缩性也导致更均匀的立方状单层，blebbistatin降低收缩性对细胞伸长无影响，cytochalasin D和latrunculin A破坏肌动蛋白应力纤维则增加细胞伸长。结果表明MT促进细胞伸长而肌动球蛋白机制对抗此效应。出乎意料的是，所有消除细胞伸长的药物处理均导致面外位移深度显著增加，伸长皱纹变为更深的酒窝状。CK666抑制Arp2/3导致皱纹深度增加，提示突起活动（可能涉及丝状伪足而非片状伪足）参与三维形变。
第八，MT破坏导致的细胞伸长受损诱导涡旋样拓扑缺陷形成。nocodazole处理下出芽事件并未完全消除，酒窝区域常与+1拓扑缺陷相关。观察到的+1拓扑缺陷呈现涡旋或低偏移角螺旋特征，细胞取向几乎围绕缺陷中心周向排列。偏移角为?3 ± 30°（距中心75至100 μm处）。细胞密度在缺陷中心附近径向衰减并在约100 μm处趋于平稳。基于向列相模型计算的牵引力可解释观察到的酒窝形状和深度。
第九，几何和力学策略用于血管生成控制。研究人员通过胶原水凝胶表面图案化操控细胞单层边缘边界条件。粘附条纹图案（400、200和100 μm宽）实验表明，随图案宽度减小，细胞排列增加，向列相序梯度降低，VEGF介导出芽发生率也降低。预先模制的人工皱纹（15 μm深、100 μm宽）在对照和VEGF条件下均未引发出芽，表明起皱是细胞流形成的结果而非原因。在芯片微血管系统中，压力诱导拉伸导致EC排列增加并伴随出芽显著减少，支持向列相序畸变促进血管出芽起始的假设。
讨论部分总结了该研究的核心发现和意义。研究人员指出，尽管先前研究已记录VEGF在协调EC形状变化和调节细胞增殖与迁移中的作用，但如何将这些多样化的细胞活动结合起来驱动特定形态发生事件仍是一个重大挑战。本研究通过研究EC组织如何贡献于血管出芽生成来弥补这一空白，具体探讨了VEGF诱导的向列相畴如何产生机械力和基底形变从而影响出芽起始。与先前研究不同，本研究聚焦于从平面内皮起始出芽的过程。研究建立的单层-出芽实验系统允许直接观察单层组织和细胞形状，并便于实施TFM和表面图案化等技术。VEGF处理诱导的平均细胞伸长增加伴随空间异质性，形成伸长排列细胞流与多边形细胞区域共存。出芽优先起源于细胞流尖端的楔形区域，这些界面向列相构型不同于经典拓扑缺陷但显示强局部向列相畸变。线性弹性模型预测的力和形变与实验观察在面内位移方面一致，但面外位移存在差异，可能归因于胶原的复杂力学性质及基质重塑等额外机制。细胞流方向上的细胞根据相对于楔形区域的位置经历拉伸或压缩应力，暗示VEGFR2表达上调的正反馈环路。药理学扰动揭示MT动力学对细胞流形成至关重要，肌动球蛋白收缩性对抗细胞伸长。nocodazole处理下尽管细胞伸长受损，出芽仍在面外形变增加的位置出现，这些位置呈现涡旋样拓扑缺陷。通过二维粘附条纹图案和三维芯片微血管拉伸实验，研究人员证明了调控细胞排列和伸长可作为控制出芽的手段。研究结论为：EC向列相序梯度作为血管出芽生成的预测标志物，向列相序、活性牵引力和VEGF信号相互作用调控血管出芽起始，这些发现为血管生成的力学生物学控制开辟了新途径，在组织工程、再生医学和抗血管生成治疗中具有潜在应用。
