缺氧条件下线粒体电子传递链对糖酵解的氧依赖性约束

《SCIENCE ADVANCES》：Oxygen-dependent constraint of glycolysis through the mitochondrial electron transport chain

　　

缺氧诱导因子（HIFs）在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）细胞中呈组成性激活。本研究探讨了这些细胞是否仍能不依赖于经典HIF激活而对缺氧作出响应。研究人员发现，缺氧引发NADH还原性应激，当细胞外丙酮酸供应受限时，该应激减弱乳酸释放；而通过异位表达胞质型和线粒体靶向的NADH氧化酶（LbNOX）可恢复该响应。当细胞外丙酮酸受限时，单独抑制线粒体电子传递链（mtETC）即足以减弱糖酵解通量，这一情况与人类ccRCC的代谢组学数据一致。此外，该响应可通过药理学或遗传学抑制线粒体复合物IV（CIV）活性来模拟，并可通过线粒体靶向的替代氧化酶（AOX）恢复。因此，研究数据表明，细胞可通过线粒体依赖性的NADH/NAD⁺比值升高来响应低氧张力，当丙酮酸可利用性受损时导致糖酵解抑制。

研究背景：缺氧诱导因子（HIFs）是细胞适应低氧张力的关键转录调控因子。常氧条件下，脯氨酰羟化酶（PHD1–3）羟化HIFα亚基的关键脯氨酸残基，促使其被von Hippel–Lindau（VHL）蛋白识别并降解。缺氧条件下，PHDs因氧不足无法充分羟化HIFα，导致HIFα稳定并核转位。HIFs在肿瘤缺氧区域被激活，但在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中因VHL蛋白缺失而组成性激活。HIFs执行的响应之一是通过减弱三羧酸（TCA）循环和线粒体电子传递链（mtETC）复合物活性来抑制氧消耗以节省氧气。然而，也有研究提出缺氧可直接降低线粒体活性而不依赖HIF通路，但由于线粒体复合物IV（CIV）细胞色素c氧化酶对氧的高亲和力（Km值≤1 mmHg），完整细胞中经细胞色素c氧化酶的细胞响应可能仅在接近无氧条件下才能被记录，这一问题存在争议。研究人员首先关注VHL缺陷型ccRCC细胞是否仍能不依赖经典HIF激活而对缺氧作出响应，考虑到这些癌中存在瘤内缺氧。研究人员聚焦于mtETC依赖性的NADH/NAD⁺比值升高（还原性应激）的作用，其细胞效应在缺氧响应中仍 largely 未知。

研究开展与结论：研究人员发现缺氧确实能不依赖HIF诱导mtETC依赖性响应，导致NADH/NAD⁺比值升高。当细胞外丙酮酸含量模拟肿瘤微环境中发现的低丙酮酸浓度时，该响应更为显著，导致糖酵解减速。此外，该响应可通过异位表达胞质型和线粒体靶向的NADH氧化酶（LbNOX）完全恢复，LbNOX将NADH转化为NAD⁺从而缓解缺氧依赖性还原性应激。mtETC抑制与糖酵解抑制之间的因果联系还得到人类ccRCC代谢组学数据的支持。人类ccRCC中典型的mtETC抑制代谢标志物与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）反应后糖酵解代谢物含量降低呈正相关。此外，该抗糖酵解响应不仅可通过药理学而且可通过遗传学抑制CIV活性来模拟。在CIV缺陷（Cox10缺陷-Cox10KO）细胞中也发现糖酵解抑制，该抑制可通过表达来自Emericella nidulans的替代氧化酶（AOX）恢复mtETC活性，或通过添加细胞外电子受体如丙酮酸或α-酮丁酸（αKB）来逆转。因此，研究数据表明细胞可通过升高线粒体NADH/NAD⁺比值在缺氧条件下抑制糖酵解通量，不依赖经典HIF激活。这种氧依赖性还原性应激响应在细胞外丙酮酸供应受限时发生，如肿瘤微环境中所见。该研究的重要意义在于揭示了线粒体可独立于经典HIF-VHL通路响应氧波动，可能通过线粒体CIV实现，并阐明了NADH/NAD⁺比值升高是此抑制的后果之一，导致糖酵解抑制，该响应在丙酮酸供应受限的实体瘤中可能发挥重要作用。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

关键技术方法：研究人员使用786-O（VHL缺陷且HIF1α缺失）细胞、G55胶质母细胞瘤细胞、HIF1β缺陷型Hepa小鼠肝癌细胞、Cox10KO小鼠皮肤成纤维细胞（MSFs）及其对照细胞。通过siRNA沉默HIF1α/HIF2α或LDH-A/LDH-B。构建稳定表达LbNOX或mitoLbNOX的786-O细胞。使用BAM15（线粒体解偶联剂）、抗霉素A（AA，CIII抑制剂）、叠氮化钠（CIV抑制剂）、丙酮酸和αKB处理。采用NAD/NADH-Glo试剂盒测定NADH/NAD⁺比值，比色法测定乳酸和丙酮酸，5-³H-葡萄糖标记测定糖酵解通量，Western blot和免疫荧光分析蛋白定位，活细胞显微镜检测NADH自发荧光。代谢组学数据来自138例配对ccRCC和癌旁健康组织。

研究结果：

opposing effects of hypoxia on lactate release independently of canonical HIF activation：786-O细胞暴露于缺氧后NADH/NAD⁺比值逐步升高（5 min至24 h），不依赖经典HIF激活。G55细胞中缺氧也升高NADH/NAD⁺比值，同时沉默HIF1α和HIF2α仅部分减弱（分别84.60±3.63%和82.64±4.29%）。HIF1β缺陷型Hepa细胞缺氧后HIF依赖基因Phd3和Pdk1表达不升高，但NADH/NAD⁺比值仍升高。786-O细胞缺氧5 min时乳酸释放初始升高，较长时间点NADH/NAD⁺比值升高伴随乳酸释放下降。G55细胞类似。

The elevation of the NADH/NAD⁺ ratio and decreased lactate release in hypoxia is restored by LbNOX and mitoLbNOX：沉默LDH-A和LDH-B足以升高NADH/NAD⁺比值。缺氧诱导的NADH自发荧光升高在胞质和线粒体区域均可见，LbNOX和mitoLbNOX减弱该升高并逆转缺氧依赖性乳酸释放抑制。αKB减弱还原性应激并恢复缺氧786-O细胞的乳酸释放。BAM15降低缺氧786-O细胞的NADH/NAD⁺比值并增加乳酸释放。

Metabolic markers of mtETC and lower glycolysis suppression in human ccRCC tumors：分析138例人类ccRCC代谢组学数据显示，与健康肾组织相比，富马酸、苹果酸和天冬氨酸水平降低，同时下游糖酵解中间产物2-PG、3-PG和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）含量减少。这些下游糖酵解中间产物的降低与富马酸、苹果酸和天冬氨酸含量相关。细胞外丙酮酸含量在无丙酮酸培养基中1小时后为11.46±1.6 μM，24小时后升至144.8±4.9 μM，因此长期处理需更换培养基以维持低丙酮酸条件。

Pyruvate-dependent inhibition of glycolytic flux upon inhibition of mtETC activity：抗霉素A（AA）处理786-O细胞引发还原性应激并抑制乳酸释放，细胞外丙酮酸或αKB可减弱NADH/NAD⁺比值升高并完全恢复乳酸释放。该响应也见于G55细胞和MSFs。AA降低糖酵解通量（³H₂O产生减少）和丙酮酸释放，表明乳酸释放减少是糖酵解通量减速的结果。

Suppressing mitochondrial CIV activity compromises glycolysis by inducing NADH reductive stress：叠氮化钠升高786-O细胞NADH/NAD⁺比值并降低乳酸释放，细胞外丙酮酸或αKB可逆转。LbNOX和mitoLbNOX减弱叠氮化物诱导的NADH/NAD⁺比值升高并部分恢复乳酸释放。G55细胞类似。

AOX restores lactate release in the absence of mitochondrial CIV：Cox10KO MSFs中COX5B蛋白显著减少，乳酸释放降低伴随NADH/NAD⁺比值升高，细胞外丙酮酸或αKB完全恢复乳酸释放并逆转NADH/NAD⁺比值升高。Cox10KO-AOX细胞中HA标记的AOX表达降低NADH/NAD⁺比值升高并部分恢复乳酸释放。

讨论部分总结：本研究提供证据表明，单独抑制mtETC（使用CIII和CIV抑制剂以及Cox10KO细胞模型）足以抑制糖酵解通量和乳酸释放。该响应也可由缺氧不依赖经典HIF激活驱动，并可被胞质和线粒体靶向的LbNOX预防。数据表明线粒体可能通过CIV感知0.5–1% O₂的氧张力，不依赖HIF活性。缺氧条件下NADH/NAD⁺比值升高和乳酸释放抑制在0.5–1% O₂即可发生。HIF1α依赖性NADH还原性应激减弱ccRCC细胞糖酵解通量，本研究进一步表明HIF1α的这一效应通过mtETC抑制实现。ccRCC中mtETC抑制相关的下游糖酵解抑制可能不仅由HIF信号组成性激活解释，还由本研究描述的缺氧依赖性NADH还原性应激驱动。G55细胞中缺氧升高NADH/NAD⁺比值仅被HIF1α/HIF2α沉默部分减弱，HIF1β缺陷型Hepa细胞中缺氧也升高NADH/NAD⁺比值，表明缺氧同时通过HIF依赖和独立机制抑制mtETC。线粒体解偶联可降低NADH/NAD⁺比值。实体瘤不仅氧水平受损而且丙酮酸等代谢物/营养素有限，为mtETC抑制时的抗糖酵解响应创造条件。LDH活性不足以在持续缺氧mtETC受损时将全部积累的NADH氧化为NAD⁺，细胞需要细胞外丙酮酸作为LDH底物促进NADH转化为NAD⁺。实体瘤中细胞周围丙酮酸浓度可能低于40 μM。ccRCC肿瘤中NADH/NAD⁺比值升高。体外研究需使用无丙酮酸培养基并更换以维持生理相关低丙酮酸条件。先前关于mtETC在缺氧细胞响应中作用的研究主要聚焦于活性氧（ROS）产生，本研究描述了NADH/NAD⁺比值对不依赖HIF的缺氧响应的影响。线粒体NADH/NAD⁺比值升高启动胞质抗糖酵解效应可能依赖苹果酸-天冬氨酸穿梭。缺氧依赖性mtETC抑制可能诱导线粒体和胞质NADH同时积累，最终减慢糖酵解通量。总之，研究数据表明线粒体可独立于经典HIF-VHL通路响应氧波动，可能通过线粒体CIV实现，NADH/NAD⁺比值在线粒体和胞质中升高是该抑制的后果之一，导致糖酵解抑制。这种缺氧和NADH依赖性响应在丙酮酸供应受限条件下更为显著，提示其可能在氧和细胞外丙酮酸供应不足的实体瘤中发挥相关作用。

研究结论翻译：总之，研究数据表明细胞可通过线粒体依赖性的NADH/NAD⁺比值升高来响应低氧张力，当丙酮酸可利用性受损时导致糖酵解抑制。这种氧依赖性还原性应激响应在细胞外丙酮酸供应受限时发生，如肿瘤微环境中所见。