《SCIENCE ADVANCES》：RNA binding by ADARs prevents RNA interference from attacking self-produced dsRNA
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生物体区分自身与外源双链RNA（dsRNA）的能力对于在需要时引发免疫反应同时防止自身免疫至关重要。研究人员利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）研究了调控dsRNA表达与功能的两种宿主途径之间的相互作用：作用于RNA的腺苷脱氨酶（A
生物体区分自身与外源双链RNA（dsRNA）的能力对于在需要时引发免疫反应同时防止自身免疫至关重要。研究人员利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）研究了调控dsRNA表达与功能的两种宿主途径之间的相互作用：作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADARs）介导的腺苷至肌苷RNA编辑与RNA干扰（RNAi）。研究发现，在ADAR突变动物中，靶向被编辑基因的小干扰RNA（siRNAs）数量显著上调。此外，尽管野生型动物中由编辑位点产生的一级siRNAs几乎完全耗竭，但二级siRNAs仍可由被编辑转录本产生，表明ADARs仅拮抗RNAi加工的第一步。研究显示ADARs在体内干扰外源性RNAi的效率，可能以防止跨沉默，并提供证据表明ADR-2与dsRNA的结合是有效抑制RNAi所必需的。该工作揭示了RNA编辑如何保护自身dsRNA免受免疫识别和副产物降解。
研究背景：腺苷至肌苷（A-to-I）RNA编辑是人转录组中最丰富的RNA修饰之一，由作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADARs）家族催化，特异性作用于双链RNA（dsRNA）。编辑位点主要位于重复基因组结构、内含子及基因3′非翻译区（UTR）。RNA编辑在哺乳动物中至关重要，其模式改变与自身免疫疾病、神经病理障碍及多种肿瘤相关。哺乳动物研究提示RNA编辑可防止自身产生的dsRNA不适当激活干扰素反应。在线虫中，ADARs与RNAi之间存在拮抗关系的证据主要来自转录组学研究，但ADARs如何干扰RNAi加工及其作用阶段尚不清楚。研究人员开展本研究旨在进一步理解RNA编辑与RNAi之间的关系，分析编辑位点产生的siRNA的数量与结构，并研究外源性RNAi是否受RNA编辑影响。研究得出结论：RNA编辑显著阻止编辑位点处一级siRNA的产生，而RdRP催化的二级siRNA生成仍可发生；ADARs结合dsRNA是阻止外源性RNAi所必需的，此机制可能防止自身转录本被RNAi识别为病毒RNA或防止跨界沉默。该研究的重要意义在于揭示了RNA编辑如何保护自身dsRNA免受免疫识别与副产物降解，为理解自身与非自身RNA区分机制提供了新视角。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。
关键技术方法：研究人员生成了野生型与ADAR突变体线虫胚胎期的小RNA测序文库，采用QsRNA-seq方法捕获5′单磷酸一级siRNA，并通过在5′连接前加入去磷酸化步骤捕获二级siRNA；利用RNA-seq分析mRNA与lncRNA表达；通过细菌喂养法进行RNAi实验并评分egl-2表型；采用实时PCR（qPCR）检测RNA水平，Western blot检测LEM-2蛋白水平；利用免疫染色与荧光显微镜分析ADR-2亚细胞定位；采用RIP实验检测ADR-2与RNA的结合；使用AlphaFold3与pyDock对ADR-2 G184R突变体与ADBP-1及RNA的复合物进行结构建模。线虫株系包括Bristol N2、BB4 adr-1(gv6);adr-2(gv42)、BB19 adr-1(tm668)、RB886 adr-2(ok735)、BB21 adr-1(tm668);adr-2(ok735)、HAH4 adr-2(gk777511)及MT1444 egl-2(n693)V。
研究结果：（1）ADAR突变体线虫中3′UTR被编辑基因的一级和二级siRNA上调。研究人员通过比较野生型与ADAR突变体中比对至各基因的siRNA数量，发现3′UTR被编辑基因在ADAR突变体中一级siRNA显著上调（P < 10??），二级siRNA在adr-1(tm668);adr-2(ok735)株系中显著上调（P < 0.003）；这些基因在mRNA水平显著下调（P < 0.01）。（2）一级siRNA不由编辑位点产生。研究人员分析比对至编辑位点的siRNA大小与结构，发现ADAR突变体中编辑位点处23-mer siRNA显著富集（P < 0.05），且野生型中所有大小的一级siRNA在编辑位点均显著耗竭（P < 0.05，21至24 nt）；二级siRNA在野生型中亦显著耗竭（P < 0.05，21至24 nt）。（3）被编辑mRNA可作为二级siRNA生成的模板。研究人员发现由编辑位点产生的反义二级siRNA富集A-to-G变化（P = 1.3 × 10??），表明被编辑转录本仍可作为RdRP合成二级siRNA的模板。（4）编辑显著降低外源性RNAi效率。研究人员针对egl-2 3′UTR富含编辑区域触发RNAi，发现野生型无严重表型，而ADAR突变体出现类似egl-2突变体的严重表型（P < 0.05），qPCR证实ADAR突变体中egl-2 RNA下调；针对lem-2的RNAi实验显示ADAR突变体中LEM-2蛋白显著下调（P < 0.05）。（5）ADAR结合而无脱氨活性即可阻止RNAi。研究人员使用adr-2(G184R)脱氨域点突变株，发现触发egl-2 RNAi不产生明显表型（P < 0.05），LEM-2蛋白水平无变化，lncRNA表达无显著降低；免疫染色显示ADR-2(G184R)蛋白显著向细胞质转移（P < 10?1?）；AlphaFold3建模提示G184R突变增强RNA结合稳定性并使脱氨域柔性增加。
讨论部分总结：研究人员讨论了A-to-I RNA编辑在哺乳动物中调控免疫系统尤其是干扰素反应的重要功能，指出线虫虽无干扰素反应但具有广泛的RNAi系统，RNA编辑可能以类似方式调控免疫。研究明确了RNA编辑抑制RNAi加工的第一步即Dicer等组件对dsRNA的识别与一级siRNA生成，而RdRP催化的二级siRNA生成不受影响；二级siRNA携带编辑变化表明siRNA生成发生在编辑事件之后。研究还讨论了ADARs可能防止自身基因被类似序列病毒触发沉默的假说，以及ADR-2(G184R)因无法释放RNA而滞留于细胞质从而阻断Dicer结合的机制模型。研究结论翻译：综上所述，研究人员发现RNA编辑位点处一级siRNA的生成被编辑过程显著阻止，而RdRP催化的二级siRNA生成仍可发生。这种对RNAi过程的干扰也影响靶向被编辑基因的外源性RNAi效率，可能防止其被RNAi识别为病毒RNA和/或防止跨界沉默。研究还表明ADAR结合是ADARs阻止外源性RNAi所必需的，提示ADR-2的dsRNA结合可能具有不同于其脱氨功能的作用。
