基于T4 RNA连接酶2缺口连接偏好性的完整微小RNA特异性检测

《Analytica Chimica Acta》：Specific Detection of Intact MicroRNA Based on Nick-Ligation Preference of T4 RNA Ligase 2

• T4 Rnl2缺口连接偏好能够特异性地检测完整miRNA。• 优化的连接条件有效抑制非特异性缺口连接。• 完整miRNA可与单核苷酸缺失及5′-去磷酸化变体区分。• 通用RNA探针结合靶标特异性夹板可实现多种miRNA的检测。引言开发微小RNA（miRNA）的精准定量方法对于疾病诊断、治疗及预后评估具有重要意义。miRNA是一类长度约19-24个核苷酸的非编码RNA，通过结合靶mRNA的3′非翻译区（3′-UTR）调控基因表达[1]，预计可调节超过60%的人类蛋白质编码基因[2]、[3]。它们广泛参与细胞增殖与分化等多种生物学过程[4]、[5]。miRNA的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关，包括癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病，凸显了其作为重要疾病生物标志物的潜力[3]、[6]、[7]、[8]。因此，开发高灵敏度、高特异性的miRNA检测方法以实现精准定量，是推进分子诊断和miRNA功能研究的关键前提。miRNA序列及其末端基团（5′-PO?和3′-OH）的完整性对维持正常生物学功能至关重要。在功能状态下，miRNA必须与Argonaute蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体（RISC）[9]、[10]。在此过程中，5′-PO?不仅是miRNA结构完整性的重要标志，也是Ago蛋白识别及后续RISC组装和活性的关键决定因素。RISC组装完成后，miRNA包含五个功能不同的区域：锚定区（g1）、种子区（g2-g8）、中心区（g9-g12）、补充区（g13-g16）和尾部区（g17-g21）[11]、[12]、[13]。这些区域协调运作，共同确保对靶基因的精准调控。生物系统中广泛存在的核糖核酸酶（RNase）容易导致miRNA的部分水解和切割，关键功能区域的破坏可能损害RISC介导的调控功能[14]。因此，常规的miRNA丰度测量不一定能反映结构完整miRNA分子的丰度。保留检测探针识别序列的降解片段即使缺乏完整序列或正常生物学功能所需的末端结构，仍可能产生阳性信号。因此，区分完整miRNA与降解片段可为常规丰度测量提供补充信息，有助于更好地理解miRNA的稳定性、代谢和功能状态。尽管当代miRNA检测方法的灵敏度和特异性取得了显著进展[15]、[16]、[17]、[18]、[19]，包括新兴的细胞原位分析策略[20]、[21]、[22]，但这些技术通常无法区分完整靶标与其降解片段。具体而言，被认为是金标准方法的茎环逆转录聚合酶链式反应（Stem-loop RT-PCR）以及环介导等温扩增（LAMP）或滚环扩增（RCA）等等温扩增方法的检测原理，主要依赖于探针与靶miRNA部分序列的杂交。近年来，各种生物传感平台被开发以进一步提高miRNA检测的灵敏度和特异性。例如，基于荧光的生物传感器、电化学传感系统和酶辅助扩增策略通过整合特异性分子识别与信号放大，实现了高灵敏度miRNA分析[23]、[24]、[25]。此外，基于DNA纳米结构和CRISPR-Cas12a的可编程扩增策略进一步提高了miRNA检测的灵敏度和可调性[26]、[27]。同时，新兴的高分辨率传感策略实现了对miRNA变体的更精确区分，例如基于3′端单核苷酸差异区分miRNA异构体，为精准miRNA分析提供了新的可能性[28]。然而，这些方法也主要基于序列特异性识别，并非专门用于检测miRNA的分子完整性。因此，这些方法本质上无法有效区分完整miRNA分子与其降解片段，容易因miRNA分解代谢物或其他具有相似3′末端序列的RNA产生假阳性信号。这种固有的模糊性严重损害了以miRNA作为临床生物标志物的诊断结果的可靠性。为克服这一固有局限性，我们报道了一种新型检测方法，利用T4 RNA连接酶2（T4 Rnl2）的内在特性选择性检测完整miRNA。T4 Rnl2对缺口（nick）结构的连接效率显著高于对间隙（gap）结构的连接效率[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。该方法能够区分完整miR159与末端截短变体，并展示了评估不同miRNA完整性的潜力。这一策略为miRNA功能和代谢的机制研究以及临床诊断应用提供了稳健可靠的技术平台。章节摘要材料本研究中使用的RNA序列（表S1）由通用生物技术公司（中国苏州）合成，DNA序列（表S2-S3）由生工生物技术公司（中国上海）合成。T4多核苷酸激酶（T4 PNK）和RNase抑制剂购自ABclonal生物技术公司（中国武汉）。T4 RNA连接酶2（T4 Rnl2）、核糖核酸酶R（RNase R）和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT）购自基因种子生物技术公司。完整miRNA检测策略为解决现有miRNA检测方法在区分靶序列完整性方面面临的挑战，我们利用T4 RNA连接酶2（T4 Rnl2）的内在特性开发了一种特异性检测完整miRNA的方法。T4 Rnl2对缺口结构的连接效率显著高于对间隙结构的连接效率[29]、[30]。该建立的方法包括四个连续步骤：连接、RNase R消化、滚环逆转录扩增……讨论基于T4 RNA连接酶2（T4 Rnl2）对缺口结构优先于间隙结构的连接特性，我们成功建立了一种能够区分完整miRNA与末端核苷酸缺失或5′-PO?缺失变体的方法。在优化的连接反应条件下，单核苷酸缺失或5′-PO?末端均会显著降低连接效率，从而最大限度减少假阳性信号，确保对完整miRNA的高特异性。T4 Rnl2催化……结论总之，这一新开发的平台利用T4 Rnl2的结构选择性来特异性识别完整miRNA，有效消除了由所测试的非完整miR159变体引起的假阳性信号。通过将连接温度提高至45 °C，抑制了所测试末端截短miR159变体形成的瞬时类缺口结构的连接，从而实现了完整miR159与这些变体的区分。该检测方法还能有效……CRediT作者贡献声明王梓怡：调查。杜书涵：调查。张宏达：数据管理。宋子婷：方法学。梁兴国：写作——审阅与编辑。安然：写作——审阅与编辑。赵明琪：写作——初稿利益冲突声明作者声明，不存在已知的竞争性经济利益或个人关系影响本文所报告的工作。生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的声明在撰写本文过程中，作者仅使用ChatGPT进行语言编辑，包括修正语法错误和改善英文文本的清晰度与流畅度。该工具未用于生成科学内容、分析数据或得出科学结论。使用该工具后，作者根据需要仔细审查和编辑了内容，并对发表文章的内容承担全部责任。利益冲突声明? 作者声明，不存在已知的竞争性经济利益或个人关系影响本文所报告的工作。致谢本工作得到山东省自然科学基金（中国，编号ZR2026MS0397，授予R.A.）、青岛中科核酸营养与产品开发联合研究中心资助（授予X.L.）、海洋食品加工与安全控制国家重点实验室开放基金（编号SKL202506，授予R.A.）以及中央高校基本科研业务费（202561052，授予Z.S.）的资助。作者感谢分析……的协助。赵明琪|宋子婷|张宏达|杜书涵|王梓怡|安然|梁兴国