《Animals》：Effects of Varying Levels of Fermented Camellia oleifera Seed Meal on Growth Performance, Biochemical Indices, and Intestinal Health in Nursery Pigs
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油茶籽粕（Camellia oleifera seed meal, CSM）是油茶榨油过程中产生的富含蛋白质的副产物，但其在动物日粮中的应用受到抗营养因子（尤其是茶皂素）的限制。本研究评估了采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Asp
油茶籽粕（Camellia oleifera seed meal, CSM）是油茶榨油过程中产生的富含蛋白质的副产物，但其在动物日粮中的应用受到抗营养因子（尤其是茶皂素）的限制。本研究评估了采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）和长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）固态发酵生产的发酵油茶籽粕对断奶仔猪生长性能、抗氧化能力、免疫状态及肠道健康的影响，并确定了最佳日粮添加水平。研究人员将84头仔猪（15.46 ± 0.10 kg）随机分为4个处理组：基础日粮（对照组）或分别添加2.5%、5.0%和7.5%发酵油茶籽粕的基础日粮，试验期48天。与对照组相比，2.5%发酵油茶籽粕在维持正常生长性能的同时，提高了中性洗涤纤维消化率、抗氧化活性、免疫相关指标、空肠形态以及紧密连接蛋白和MUC-2的表达。产丁酸菌柯林斯菌属（Collinsella）的相对丰度发生改变，结肠丁酸对梯度发酵油茶籽粕添加量呈显著二次响应；同时异己酸浓度降低。相反，添加量达到5.0%及以上时，对生长、养分利用和肠道健康产生负面影响。总体而言，仔猪对发酵油茶籽粕添加量呈倒U型响应，2.5%被确定为最适添加水平。本研究为发酵油茶籽粕作为保育猪日粮中常规饲料原料的潜在部分替代品提供了理论基础。
一、研究背景与意义
全球养猪业正面临蛋白质饲料供应短缺的关键瓶颈。作为传统的主要蛋白质来源，豆粕（soybean meal, SBM）的应用受到多重因素制约，已成为影响养猪业可持续发展的关键因素。在燃料—饲料—粮食竞争日益激烈的背景下，寻求优质低价的饲料原料是促进畜牧业长期可持续发展的核心举措。中国作为全球最大的大豆进口国，超过85%的大豆消费依赖进口且来源高度集中，使养猪业面临地缘政治、贸易和气候等多重不确定性。豆粕占中国畜禽饲料原料总量的15%，其供应稳定性直接影响饲料成本和肉类供需平衡。因此，开发成本效益高、供应稳定的豆粕替代饲料原料已成为畜牧和饲料行业的当务之急。
油茶籽粕（CSM）是榨油过程中产生的副产物，富含蛋白质、多酚、茶皂素、多糖等营养和生物活性成分，具有作为新型饲料原料的巨大潜力。然而，CSM目前主要用于茶皂素回收及化工和化妆品行业，大部分被废弃或仅用于低价值场景，其饲料潜力尚未得到充分开发。主要限制因素在于CSM含有2%~7%单宁、1.5%~3%生物碱以及高水平的茶皂素等抗营养因子（anti-nutritional factors, ANFs）。茶皂素的苦味和毒性是其在饲料中利用的关键瓶颈，过量摄入可诱发动物红细胞溶血甚至死亡。克服茶皂素的限制已成为CSM饲料化利用的核心技术挑战。
微生物发酵作为一种绿色高效的生物加工策略，可在降低CSM中抗营养因子的同时产生肽类、有机酸和酚类化合物等有益代谢产物，从而改善饲料的营养品质和功能特性。枯草芽孢杆菌、黑曲霉和长枝木霉是公认的饲料应用安全微生物（generally recognized as safe, GRAS），已有研究证实这些菌株可增强猪的生长性能、养分利用、抗氧化状态和肠道屏障完整性。然而，尚无已发表的研究评估这三种微生物联合发酵的CSM在保育猪中的应用效果，其对生长性能和肠道健康的影响及潜在机制在很大程度上仍属未知，最佳日粮添加水平也尚未确定。
二、研究内容与主要结论
本研究采用枯草芽孢杆菌、黑曲霉和长枝木霉混合菌种对油茶籽粕进行固态发酵，评估不同日粮添加水平（2.5%、5.0%、7.5%）对保育猪生长性能、抗氧化状态、免疫应答和肠道健康的影响。结果表明，发酵处理使茶皂素含量从203.49 ± 8.40 mg/g干物质降至26.94 ± 1.52 mg/g干物质，降解率达86.76%。2.5%添加水平在维持正常生长性能的同时，改善了养分消化率、抗氧化能力和免疫功能，并促进了肠道健康；而5.0%及以上添加水平则对生长性能和肠道健康产生不利影响。仔猪对发酵油茶籽粕添加量呈倒U型响应，2.5%为最适添加水平。该研究首次明确了发酵油茶籽粕在保育猪日粮中的安全剂量窗口和毒性阈值，为油茶籽粕作为新型替代蛋白质饲料原料的应用提供了科学依据。
三、主要关键技术方法
本研究采用固态发酵技术制备发酵油茶籽粕，以油茶籽粕与麦麸按8:2（w/w）比例混合作为发酵底物，接种三种微生物混合悬浮液（体积比1:1:1），在33°C条件下发酵4天。动物试验选用84头杜洛克×长白×约克夏（DLY）保育猪（50日龄，初始体重15.46 ± 0.10 kg），随机分为4个处理组，每组7个重复栏，每栏3头猪，试验期48天。研究运用了代谢试验测定表观养分消化率（以酸不溶性灰分为内源指示剂）、ELISA法检测血清和空肠黏膜免疫因子及抗氧化指标、苏木精-伊红（H&E）染色进行肠道组织形态学分析、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测空肠黏膜屏障和免疫相关基因表达、PacBio Sequel IIe平台进行结肠微生物16S rRNA基因高通量测序，以及气相色谱-质谱联用（GC-MS）定量结肠短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）。
四、研究结果
（一）生长性能与表观养分消化率
日粮添加发酵油茶籽粕对保育猪末重（FBW）、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F:G）有极显著影响（p < 0.001）。与对照组相比，FCSM2.5组上述指标无显著差异（p > 0.05）；但FCSM5和FCSM7.5组的FBW、ADG和ADFI显著降低，F:G显著升高（p < 0.05）。随着发酵油茶籽粕添加水平增加，FBW、ADG和ADFI呈线性和二次性下降（p ≤ 0.001），F:G呈线性和二次性升高。养分利用方面，FCSM2.5组的粗蛋白质（CP）消化率高于FCSM7.5组（p < 0.05），中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）消化率显著高于对照组和FCSM7.5组（p < 0.01），且均呈现显著的二次响应。
（二）发酵油茶籽粕对保育猪空肠和血清抗氧化能力的影响
在空肠黏膜中，所有发酵油茶籽粕处理组的T-AOC值均高于对照组（p < 0.05），呈极显著线性响应（p < 0.001）；T-SOD活性在各添加组均显著升高（p < 0.01），呈显著二次效应（p = 0.002）；GSH-Px活性随添加水平增加呈线性升高（p = 0.033）。在血清中，发酵油茶籽粕补充组的T-AOC和T-SOD活性显著高于对照组（p < 0.05），T-AOC呈显著线性增加（p = 0.002），T-SOD同时受线性和二次响应影响（p < 0.001）。CAT活性和MDA含量在各处理间无显著差异。
（三）发酵油茶籽粕对保育猪空肠和血清免疫功能的影响
在空肠黏膜中，FCSM2.5组的IL-10和IgA浓度高于对照组和FCSM7.5组（p < 0.05）；FCSM7.5组的IFN-γ水平高于对照组和FCSM2.5组（p < 0.05）。IL-10和IgA呈显著二次响应（p ≤ 0.009），IFN-γ呈极显著线性增加（p < 0.001）。在血清中，FCSM2.5组IgA浓度显著高于对照组（p < 0.05）；FCSM7.5组的IL-10和IgG水平显著降低（p < 0.05），IL-10和IgG呈显著线性下降（p ≤ 0.023），IgA呈显著二次响应（p = 0.021）。Pearson相关性分析显示，血清IgA与空肠IgA极显著正相关（r = 0.74, p < 0.01），血清IL-10与空肠IL-10极显著正相关（r = 0.64, p < 0.01），表明血清免疫指标可可靠反映空肠黏膜的局部免疫状态。
（四）发酵油茶籽粕对保育猪肠道形态的影响（H&E染色，100×）
日粮添加发酵油茶籽粕对十二指肠和回肠的绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD）及VH:CD比值无显著影响（p > 0.05）。但空肠VH和VH:CD比值在各处理间差异显著（p ≤ 0.032）：FCSM2.5组的空肠VH高于对照组和FCSM7.5组（p < 0.05），VH:CD比值也显著升高（p < 0.05），两者均呈显著二次响应（p < 0.01）。组织学观察显示，FCSM2.5组空肠绒毛结构完整、排列紧密有序，而FCSM7.5组出现明显的绒毛萎缩、断裂和上皮细胞脱落。
（五）发酵油茶籽粕对保育猪空肠黏膜相关基因mRNA相对表达的影响
日粮添加发酵油茶籽粕显著影响空肠免疫和炎症相关基因IGHA、IGHG、IL1B和IL10的表达（p < 0.05）。FCSM2.5组IGHA和IGHG表达水平显著高于对照组（p < 0.05）；FCSM7.5组促炎基因IL1B表达高于FCSM2.5组（p < 0.05），而抗炎基因IL10及免疫球蛋白相关基因IGHA和IGHG表达显著低于FCSM2.5组（p < 0.05）。肠道屏障相关基因方面，FCSM2.5组ZO-1和MUC2表达显著高于对照组（p < 0.05）；FCSM7.5组ZO-1、Occludin和Claudin-1表达显著低于FCSM2.5组（p < 0.05）。
（六）发酵油茶籽粕对保育猪结肠微生物的影响
所有样本的Good's coverage值均超过0.99，测序深度充足。α多样性指数（Shannon、Chao1、Ace、Simpson）在各组间无显著差异（p > 0.05）。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）结合ANOSIM显示，各组结肠微生物群落结构存在统计学显著但较弱的差异（R = 0.14691, p = 0.011）。厚壁菌门（Bacillota）和变形菌门（Pseudomonadota）为优势菌门，合计占微生物群落的90%以上；属水平上，Limosilactobacillus和Lactobacillus为最丰富菌属，合计占总相对丰度的50%以上。LEfSe分析（LDA > 2.0）鉴定出组间差异标志菌属：Agathobacter和Lactococcus富集于对照组，Collinsella为FCSM2.5组特征菌属，Streptococcus富集于FCSM5组，Lactobacillus、Weissella和Bacillus主要与FCSM7.5组相关。
（七）发酵油茶籽粕对保育猪结肠短链脂肪酸的影响
丁酸浓度在各处理间无显著差异（p = 0.128），但随发酵油茶籽粕添加水平增加呈显著二次响应（p = 0.025）。异己酸受发酵油茶籽粕添加的显著影响（p = 0.006），随添加水平增加呈线性下降（p = 0.002）；FCSM2.5和FCSM5组的异己酸浓度低于对照组（p < 0.05）。乙酸、丙酸、戊酸、己酸、异丁酸和异戊酸浓度不受日粮处理影响（p > 0.05）。
（八）关键差异菌属与肠道健康及生长性能指标的相关性分析
富集于FCSM2.5组的Collinsella与Claudin-1表达、MUC2表达和空肠绒毛高度呈正相关（p < 0.05），与空肠IFN-γ浓度和料重比呈负相关（p < 0.05），并倾向于与ZO-1表达和平均日增重正相关（p < 0.10）。FCSM5组特征菌属Streptococcus与多项养分消化率和肠道健康指标呈正相关，与促炎因子和料重比呈负相关（p < 0.05）。对照组富集的Agathobacter与空肠IgA、T-SOD活性和MUC2表达呈负相关（p < 0.05）。FCSM7.5组富集的Dysosmobacter与空肠促炎细胞因子IFN-γ呈极显著正相关（p < 0.01），与ZO-1表达和平均日增重呈负相关（p < 0.05）。
五、讨论与结论
讨论部分指出，发酵油茶籽粕对保育猪的影响呈明确剂量依赖性，呈倒U型响应模式。适量添加（2.5%）时，复合益生菌在发酵过程中合成的皂苷降解酶可有效裂解茶皂素中连接苷元极性基团和β-1,4-糖苷键的四糖单元结构，将茶皂素转化为溶血活性较弱、毒性较低的衍生物，同时改善饲料适口性。当添加水平达到5.0%及以上时，残留抗营养因子的累积效应超过保育猪耐受阈值，其苦味和涩味降低采食量，抗营养因子直接刺激肠黏膜、损害屏障完整性并诱导炎症，最终形成"采食量下降—消化吸收受损—生长受阻"的恶性循环。在抗氧化和免疫调节方面，适量发酵油茶籽粕通过茶皂素固有活性与发酵产物的协同作用增强机体抗氧化防御能力，促进抗炎反应和体液免疫；高剂量则从免疫调节转为免疫抑制，触发局部肠道炎症。在肠道微生态方面，发酵油茶籽粕通过调节特定菌属（如富集产丁酸菌Collinsella）的相对丰度，在维持核心菌群稳态的同时优化肠道发酵模式，减少蛋白质腐败代谢物（如异己酸）的积累。从实际应用角度看，油茶籽粕成本仅为豆粕的30%~40%，经简单固态发酵处理后，2.5%日粮添加可在不降低保育猪生长性能的情况下使饲料成本降低约1.5%~2%，且固态发酵工艺对生产设备要求低、操作简单，易于在商业饲料厂大规模推广。
研究结论：本研究证实，复合益生菌发酵油茶籽粕对保育猪的生长性能、抗氧化状态、免疫功能和肠道健康产生剂量依赖性影响，呈倒U型响应模式。2.5%添加水平有效降低了抗营养因子的不利影响，同时增强了养分消化率、抗氧化能力和免疫应答，这些有益效应与空肠形态改善、屏障和抗炎相关基因表达增加、结肠微生物组成调节、产丁酸菌属Collinsella富集以及短链脂肪酸代谢改善相关。相反，5.0%及以上添加水平对生长性能和肠道健康产生不利影响，可能归因于抗营养因子的残留效应。因此，在本研究条件下，2.5%为发酵油茶籽粕的最适添加水平，该原料可作为保育猪日粮中具有潜力的新型饲料原料。
