光合赋能跨界嵌合干细胞（PCSs）作为线粒体电池通过线粒体转移与FGF21分泌促进糖尿病创面修复

《SCIENCE ADVANCES》：Photosynthetic chimeric stem cells function as mitochondrial batteries

　　

基于线粒体转移的疗法在修复功能失调、能量匮乏细胞方面具有前景。然而，作为线粒体供体的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）受限于植入效率低、异常分化风险及转移效率低。为此，研究人员将植物来源的基于类囊体的人工细胞核与编码FGF21的信使RNA（messenger RNA, mRNA）导入去核骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs），构建了光合赋能跨界嵌合干细胞（photosynthesis-empowered cross-kingdom chimeric stem cells, PCSs；“线粒体电池”）。光合活性增强线粒体向受损细胞的转移以恢复其代谢，并提高合成代谢以增加FGF21产生。FGF21持续释放促进线粒体生物发生并维持长期细胞能量稳态。小鼠和猪创面愈合模型显示，PCSs可补充细胞能量以加速创面修复。该光激活细胞光合平台支持模块化mRNA可编程性，不引起植入或异常分化，并允许重复给药以用于多种治疗应用。

研究背景与问题：缺血、氧化应激、炎症或细胞衰老等病理状态可导致细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）同时下降，形成能量货币“双重缺陷”。该缺陷增加线粒体通透性，激活诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS），加重线粒体复合体I亚基损伤，形成“能量下降—氧化损伤”正反馈；Na⁺/K⁺-ATPase等ATP依赖离子泵失效后膜电位崩溃，细胞由功能衰退进入不可逆凋亡或坏死。线粒体转移被视为维持线粒体动态平衡的修复策略，但直接分离线粒体难以控制胞外环境并保证完整性；MSCs在糖酵解状态下生物能量需求低，倾向向能量受损细胞供献线粒体，但自然转移效率通常低于5%，转移线粒体在受体细胞内存活短，难以形成持续功能效应；上调Miro1、Cx43或合成技术等增强转移策略费时费力，干细胞治疗还存在植入后异常分化风险。去核MSCs保留疾病靶向和旁分泌能力，并因去核消除体内不可预测分化和伦理问题，但去核后线粒体功能进行性下降，线粒体转移率和质量明显受损。类囊体可通过光合作用光反应产生NADPH和ATP，据报道可缓解线粒体应激并促进受损线粒体快速恢复。慢性大面积创面中活性氧（reactive oxygen species, ROS）升高可诱导线粒体损伤和合成代谢受损；FGF21无促有丝分裂活性、不诱导增殖相关副作用，而特异性调控细胞能量代谢和线粒体稳态。因此，研究人员构建PCSs：将编码FGF21的mRNA和植物来源类囊体经细胞膜包裹形成合成细胞核，再导入去核BMSCs，以增强线粒体转移效率，并利用类囊体产生的ATP促进FGF21翻译和分泌；在小鼠和猪创面模型中验证其转移线粒体和分泌FGF21、恢复细胞能量代谢并促进创面愈合的作用。该论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

主要关键技术方法：研究人员从新鲜菠菜分离类囊体并挤出制备纳米类囊体单元（nanothylakoid units, NTUs），将BMSC膜、NTUs与编码FGF21的mRNA组装为MTF-Core，再与去核BMSCs共孵育构建PCSs。体外采用H₂O₂刺激L929成纤维细胞及HUVEC，检测线粒体转移、耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）、ATP/NADPH、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）、ROS、FGF21分泌、迁移和AMPK/PGC-1α通路。体内采用链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的C57BL/6J小鼠糖尿病全层创面模型（伦理号SAHZU 2025-081）和Bama minipig全层大面积创面模型（伦理号SAHZU 2025-111），并分析人糖尿病创面单细胞RNA-seq队列（Diabetic_noDFU、Healing_DFU、Nonhealing_DFU）及创面组织RNA-seq数据（GEO：GSE283228、GSE348063）。

研究结果：1）线粒体损伤破坏能量稳态并阻碍创面愈合。通过糖尿病小鼠创面转录组基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）、人创面单细胞RNA-seq、线粒体复合体IV活性、ATP含量、PGC-1α表达及H₂O₂刺激L929细胞的MitoSOX和JC-1检测，发现糖尿病创面氧化应激反应和线粒体功能障碍相关通路富集，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）下调，复合体IV活性和ATP生成受损，PGC-1α降低，线粒体ROS升高且MMP丢失，提示氧化应激导致线粒体损伤和细胞能量代谢障碍。2）PCSs的合成与表征。去核后干细胞MMP和ATP随时间下降；类囊体D1、D2蛋白在光照下8—16 h快速降解、黑暗下5—7 d几乎完全降解；构建的MTF-Core经cryo-TEM显示核壳结构，动态光散射约197 nm，zeta电位和Western blot验证膜包覆及D1、D2、CD9、CD63存在；蛋白组富集于叶绿体代谢、ATP合成、氧化还原稳态和电子传递；MTF-Core可高效进入去核细胞胞质并与溶酶体标记低共定位；光照下PCSs的OCR、ATP和NADPH生成、FGF21分泌及迁移增强，ROS累积降低。3）PCSs的治疗效果与机制。在L929氧化应激模型中，PCSs条件培养基（conditioned medium, CM）上调PGC-1α并优于外源重组小鼠FGF21；双MitoTracker和流式细胞术证实线粒体转移，GW4869使双阳性事件近乎消失；rotenone处理PCSs后不能恢复ATP，物种特异性线粒体DNA qPCR和mitoEVs的TEM及COX IV Western blot证实功能性线粒体经囊泡转移；RNA-seq显示CM使L929转录组向健康基线回归，上调氧响应和糖酵解相关基因，富集ADP代谢、碳水化合物合成、抗氧化防御、三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环、脂肪酸合成和OXPHOS；JC-1和OCR显示CM_NTU+mFGF21对MMP和线粒体呼吸的恢复最强；AMPK抑制剂compound C消除CM对pAMPK/AMPK和PGC-1α的作用，证明其经AMPK/PGC-1α轴保护氧化应激所致线粒体功能障碍；HUVEC中PGC-1α核积累及NRF1、NRF2上调。4）PCSs促进糖尿病创面愈合。在STZ诱导糖尿病小鼠全层创面中，PCSs载入PLGA-PEG-PLGA水凝胶，包封率约86%，96 h内缓释，Fluc示踪显示第1天创面强信号、第9天不可测；PCSs组第14天完全再上皮化，创面闭合率、残余创面长度和胶原沉积优于对照、Gel、PCSs_NTU和PCSs_mFGF21组；光照PCSs_Light组闭合和再上皮化优于Gel和PCSs_Dark组。5）PCSs通过线粒体转移和促线粒体生物发生加速糖尿病创面愈合。创面免疫荧光显示PCSs可向创面细胞转移线粒体，GW4869抑制该作用；转移线粒体与内皮细胞CD31、成纤维细胞vimentin和角质形成细胞Krt14共定位；rotenone预处理消除PCSs恢复ATP的能力；PCSs组创面ATP、p-AMPKα和PGC-1α升高，iNOS降低，血管数量增加。6）PCSs在全层猪皮肤创面模型中促进愈合。在Bama minipig 3 cm大面积全层创面中，PCSs组第14、21天愈合率高于PBS和Gel组，第28天近完全愈合；H&E显示创面长度缩短和再上皮化，Masson显示第28天胶原沉积增加。安全性方面，血清ALT、AST、BUN、CREA无显著差异，TNF-α和IL-1β降低，主要器官H&E未见病理异常，支持类囊体组分的生物相容性。

讨论总结与研究结论翻译：讨论指出，细胞能量缺乏是合成不足、功能衰退和细胞死亡的主要原因之一，衰老、氧化应激损伤和高糖微环境均可损害线粒体功能，降低ATP生成并损害细胞能量代谢和活力。研究人员报道的“光合赋能嵌合细胞”由BMSC胞质体与合成“类囊体-FGF21 mRNA纳米核”共组装而成，利用类囊体光合作用将光能转化为即时可用的ATP和NADPH，同时FGF21持续释放促进线粒体生物发生，实现从即时能量救援到长期代谢恢复的衔接；在猪大面积创面模型中取得优于对照的治疗结果。既往工作显示工程化去核BMSC具有较强旁分泌能力，但无核后线粒体功能进行性恶化，ATP不足导致转导mRNA翻译和释放失败；引入类囊体后，光照产生ATP直接供能并提供NADPH恢复线粒体氧化还原平衡，光照PCSs的ATP水平、迁移活性和mRNA合成增加。研究使用线粒体染料检测转移，并以rotenone抑制PCSs线粒体活性、GW4869抑制囊泡释放及流式分析排除染料泄漏假阳性，证明作用依赖功能性线粒体递送。治疗策略强调线粒体完整性和功能能力，避免转移受损线粒体；类囊体光合作用产生ATP使去核细胞作为蛋白制造工厂的能力提高2.15倍，NADPH提供还原当量清除ROS，避免转移损伤线粒体风险。平台依赖光驱动光合活性，研究中采用80 μmol photons m^?2 s^?1；红光630 nm在小鼠3 mm厚度皮肤和肌肉的透过率分别约58.1%和49.8%，足以用于皮肤创面、角膜损伤或黏膜等浅表应用，但不足以覆盖深部器官；提高辐照度可能增加深层光子通量但存在光热损伤风险，深部应用可考虑上转换纳米粒子（upconversion nanoparticles, UCNPs）将近红外光转为可见光，或采用声动力激活。研究结论翻译：研究人员设计了一种“线粒体电池”嵌合干细胞，能够实现即时能量代谢修复和长期能量稳态维持的时间调控；这是首个将植物来源类囊体膜与去核BMSCs整合、并利用光合作用促进线粒体转移的细胞基重建光合平台；PCSs不引起植入或异常分化，确保重复给药安全性；该能量恢复策略是可推广平台，可能适用于多种退行性疾病；PCSs设计还是可编程mRNA编辑平台，通过替换mRNA序列或引入多种mRNA产生不同功能蛋白，有望治疗多种疾病；该工作克服了传统线粒体治疗策略的局限，显示出临床潜力，仍需进一步临床验证。