综合转录组分析鉴定hspa9作为大口黑鲈急性热应激潜在热保护候选基因

《Aquaculture》：Comparative transcriptomic profiling identifies hspa9 as a potential thermoprotective candidate during acute heat stress in Micropterus salmoides

　　

本研究表征了大口黑鲈（Micropterus salmoides）热敏感（heat sensitive, HS）与耐热（heat tolerant, HT）个体在热应激（heat stress）下的组织损伤反应及相应分子调控特征。研究人员鉴定并筛选出与热应激相关的关键基因hspa9，并通过实验验证证实其在热应激下具有潜在保护作用（potential protective role）。

研究背景与问题：全球变暖加剧极端高温事件，对水生生态系统形成持续热胁迫。鱼类为变温动物，不能主动调节体温；水温超过物种热耐受限度会损害生长、发育、存活和繁殖，极端热条件下可致死。热应激可降低抗氧化酶活性、抑制基础代谢并加速细胞凋亡；鱼类则通过行为、生理、生化和分子调整，激活应激反应与细胞存活级联，上调抗氧化酶清除活性氧（ROS, reactive oxygen species），并增强热休克蛋白（HSPs, heat shock proteins）合成以提高细胞耐热性、稳定蛋白稳态和减轻热损伤。大口黑鲈为高值淡水养殖种，最适生长约25–29 °C，急性热应激中位致死温度（LT₅₀, median lethal temperature）为37.25 °C；夏季持续高温抑制摄食和饲料效率、降低生长与抗逆性。已有脑、鳃、肝多组织转录组研究多聚焦群体水平，个体间耐热差异的分子机制及同种个体耐热差异的遗传基础仍不清楚。为此，研究人员选择不同耐热表型个体，开展多组织比较转录组研究，比较热敏感（HS）与耐热（HT）个体的生理反应和分子调控谱，筛选调控耐热的核心功能基因，为耐热养殖品种遗传改良提供候选基因资源。

关键技术方法：研究人员以120尾4月龄大口黑鲈“Yanlu No. 1”（来源：Huzhou Rongsheng fishery technology Co., Ltd., Zhejiang, China）为样本，均重185.32±17.96 g、全长21.85±0.81 cm。基础水温26 °C，按1 °C/h升至38 °C并持续暴露，以平衡丧失（LOE, loss of equilibrium）为终点，将38 °C持续3 h最先LOE个体定为HS、6 h最晚LOE个体定为HT，于0、12、15（HS）、18 h（HT）采样。检测血清谷胱甘肽过氧化物酶（GPx, glutathione peroxidase）、超氧化物歧化酶（SOD, superoxide dismutase）、丙氨酸氨基转移酶（ALT, alanine aminotransferase）、丙二醛（MDA, malondialdehyde）；鳃、脑、肝行苏木精-伊红（HE, hematoxylin-eosin）染色，并行蛋白质印迹（WB, Western blot）和免疫荧光（IF, immunofluorescence）；脑、肝行Illumina转录组测序（NovaSeq X Plus，16×/sample），fastp质控、HISAT2比对、RSEM定量、DESeq2筛选差异表达基因（DEGs, differentially expressed genes）（P-adjust<0.05且|log₂FC|≥1），行基因本体（GO, Gene Ontology）/京都基因与基因组百科全书（KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集；实时定量PCR（RT-qPCR, real-time quantitative PCR）验证6个DEGs（β-actin内参），SPSS 19.0单因素方差分析（P<0.05）。

研究结果：
3.1 Changes in serum biochemical parameters and key tissues：血清GPx、SOD、ALT、MDA呈动态变化。12 h时GPx活性显著升高（P<0.001）、SOD升高，ALT显著降低（P<0.001），MDA下降；随热应激延长GPx和SOD下降、ALT回升，MDA保持较低。HE显示鳃损伤随时间加重：12 h次级鳃片弯曲变形及末端和基部增生肥大；15 h（HS）次级鳃片变短变薄、基部水肿增生加重、上皮细胞水肿；18 h（HT）末端更肿胀，上皮细胞肥大、破裂、脱落及明显细胞空泡化。脑损伤呈时间依赖：12 h局灶间质水肿；15 h（HS）细胞水肿增多、水肿区扩大；18 h（HT）弥漫间质水肿、细胞水肿和细胞坏死。肝出现肝细胞早期肥大空泡化、坏死、核固缩和核溶解，晚期严重肝细胞坏死、肝窦扩张、脂肪变性和炎症浸润。
3.2 Transcriptome data analysis and DEGs：24个组织样本获168.64 Gb高质量clean data，Q30>94.88%；比对参考基因组GCA_022435785.1的有效比对率为92.46%–95.98%，相关性和主成分分析（PCA, principal component analysis）显示组内重复聚类紧密、离散低。共鉴定53,859条转录序列，含24,416条已知转录本和29,443条新转录本。三组比较中脑上调DEGs为1099、562、59，下调为954、288、178；肝上调为1791、716、488，下调为2046、588、833。脑共有17个DEGs、肝171个共享DEGs，提示肝通过大量核心基因持续调控建立持续转录重编程，脑主要为时限性阶段特异反应并仅保留少量保守基因维持神经转录稳态。
3.3 Functional enrichment of DEGs：GO显示脑12 h vs 0 h富集ATP依赖蛋白折叠伴侣、蛋白折叠伴侣、抗原加工提呈；15 h vs 12 h富集细胞外区域、补体激活、丝氨酸型肽酶活性；18 h（HT）vs 15 h（HS）富集细胞外空间、铁离子结合、丝氨酸型内肽酶活性。肝12 h vs 0 h与脑共享ATP依赖蛋白折叠伴侣、催化活性、蛋白折叠伴侣；15 h vs 12 h富集小分子代谢过程、羧酸代谢过程、催化活性；18 h（HT）vs 15 h（HS）转向羧酸代谢、含氧酸代谢、小分子代谢过程。KEGG显示脑12 h vs 0 h富集内质网（ER, endoplasmic reticulum）蛋白加工、抗原加工提呈、DNA复制；15 h vs 12 h富集补体和凝血级联、糖酵解/糖异生、胆固醇代谢；18 h（HT）vs 15 h（HS）富集补体和凝血级联、胆固醇代谢、脂肪消化吸收。肝12 h vs 0 h富集内质网蛋白加工、一碳池叶酸、半胱氨酸和蛋氨酸代谢；15 h vs 12 h富集过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR, peroxisome proliferator-activated receptor）信号通路、胰岛素抵抗、缺氧诱导因子-1（HIF-1, hypoxia-inducible factor-1）信号通路；18 h（HT）vs 15 h（HS）富集内质网蛋白加工、氨酰tRNA生物合成、类固醇生物合成。
3.4 Weighted gene co-expression network analysis：基于脑7986个基因和肝10,513个基因，加权基因共表达网络分析（WGCNA, weighted gene co-expression network analysis）在脑和肝分别鉴定17和21个模块。脑与热应激最相关模块为Meturquoise（1993个基因）、Metan（139）、Mecyan（118）、Mebrown（1080）；肝为Mebrown（819）、Melightyellow（51）、Meblue（1988）、Memidnightblue（86）。将关键功能模块基因与DEGs交集，脑和肝分别获1150和1419个核心DEGs。脑top DEGs主要富集内质网蛋白加工、抗原加工提呈、DNA复制、炎症性肠病通路；肝top DEGs主要富集内质网蛋白加工、核质运输、真核核糖体生物发生、脂质和动脉粥样硬化进展。研究还识别各时间点top 80关键DEGs的共享和组织特异时序表达谱，提示脑与肝通过共享核心通路协调器官间通讯，又以不同器官特异基因网络维持组织稳态，DEGs异步表达显示两器官热诱导病理改变的时空异质性。蛋白-蛋白相互作用（PPI, protein-protein interaction）网络显示HSP基因为hub节点：脑hub HSPs包括hsp90a、hsp90b、hspa9、hspa5，肝核心基因为hsp90a、hspa9、hspa5，提示HSPs作为中心功能分子参与抵抗热诱导组织损伤，HSPs调控的蛋白稳态维持是高度保守的重要耐热机制。
3.5 RT-qPCR verification：从脑和肝DEGs中筛选hif-1α、hsp90α、mcm6、cacybp、hspa1s、plin 6个热应激响应基因，功能注释涉及HIF-1信号通路、内质网蛋白加工、DNA复制、Wnt信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK, mitogen-activated protein kinase）信号通路、PPAR信号通路。RT-qPCR表达谱与RNA-seq高度一致，验证了转录组数据可信性。
3.6 The expression of hspa9 / HSPA9 under heat stress：选择hspa9（Mortalin，线粒体伴侣蛋白）检测其在鳃、脑、肝中的表达。qPCR显示热应激诱导hspa9上调，脑12 h显著升高（P<0.05），肝12 h–18 h显著升高（P<0.001）。WB和IF显示HSPA9蛋白在各组织均可检测，蛋白表达模式与hspa9 mRNA基本一致；IF显示HSPA9主要定位于细胞质。结果进一步证实hspa9可能在热应激反应中起关键保护作用。

讨论部分总结：讨论指出，热应激导致ROS过量积累并引发氧化应激，限制鱼类生长和代谢；SOD、过氧化氢酶（CAT, catalase）和GPx可通过调节ROS积累减轻氧化应激。本研究中血清GPx、SOD、ALT、MDA动态反映急性热应激下渐进性生理和氧化反应：早期GPx和SOD活性升高表明抗氧化防御系统快速激活，减轻脂质过氧化并降低MDA；血清ALT显著降低可能源于早期急性应激抑制肝ALT合成；持续热应激使抗氧化酶活性下降，提示ROS清除能力受损。脑组织出现弥漫间质水肿、细胞水肿和细胞坏死，损伤程度存在明显个体异质性，提示HS（15 h）与HT（18 h）间的内在分子调控差异是关键因素；HT脑关键通路包括补体和凝血级联、胆固醇代谢、脂肪消化吸收、MAPK和HIF-1信号通路，讨论认为热应激破坏血脑屏障并触发补体和凝血级联，驱动微血栓和局灶脑缺血，继而代偿激活HIF-1信号通路；热刺激激活MAPK级联促进促炎细胞因子释放和细胞凋亡；脑脂质稳态紊乱（胆固醇代谢重编程及脂肪消化吸收失调）改变膜流动性和脂质信号，与血栓炎症反应形成恶性循环并放大组织损伤，最终导致严重脑水肿和神经元坏死。肝出现严重肝细胞坏死、肝窦扩张、脂肪变性和炎症浸润，关键通路包括内质网蛋白加工、氨酰tRNA生物合成和类固醇生物合成；热应激引起肝细胞大量蛋白变性，内质网蛋白加工通路激活未折叠蛋白反应以复性或降解错误折叠蛋白；氨酰tRNA生物合成协调翻译能力，为应激响应蛋白合成提供底物；持续热损伤下异常肽积累加剧内质网应激并触发肝细胞凋亡；类固醇生物合成发生代谢重编程以维持膜固醇稳态，失调导致脂质沉积和脂毒性，与内质网应激协同加重肝损伤。脑和肝为维持鱼类重要生理功能的关键器官，脑启动应激信号级联，肝调节代谢并激活防御反应，二者密切互作维持机体稳态；脑肝共享DEGs提示组织特异表达谱和功能基因多样性与热应激紧密相关。HSPs对获得耐热性至关重要，参与信号转导、抗氧化防御、凋亡和蛋白折叠；本研究鉴定hsp90a、hsp90b、hspa9、hspa5，其中hspa9（mortalin，HSP70家族成员）参与核酸成熟、细胞信号转导、囊泡运输、线粒体蛋白输入、折叠和降解。热应激早期hspa9随温度升高和暴露时间延长而上调，提示其潜在保护功能；HT（18 h）部分组织中hspa9表达下降，可能与过度热应激有关。讨论还指出hspa9可抑制ROS积累，热应激提高HSPA9表达以维持线粒体蛋白稳态和线粒体膜电位，抑制PINK1-Parkin线粒体自噬通路激活，构成重要保护机制；基础水平线粒体自噬仍可清除少量受损线粒体，共同支持线粒体质量监控，其详细功能调控机制尚需后续研究。

研究结论翻译：热应激引发大口黑鲈鳃、脑和肝深度氧化应激损伤，损害呼吸和渗透调节、中枢神经信号转导、肝代谢和解毒功能，干扰机体应激适应并最终危及鱼生存。利用比较转录组学，本研究剖析了HS和HT个体固有分子调控差异。脑主要富集通路包括补体和凝血级联、胆固醇代谢、脂肪消化吸收、MAPK和HIF-1信号通路；肝核心通路包括内质网蛋白加工、氨酰tRNA生物合成和类固醇生物合成。综上，这些发现表明，尽管热应激诱导的氧化应激损伤重要组织，不同组织应激反应存在显著异质性，反映热适应背后复杂动态调控网络。此外，研究人员鉴定关键热应激相关基因hspa9并表征其热应激下组织表达谱。本研究为理解鱼类热应激分子调控机制和抗逆选择性育种提供重要参考。