PfTLR4类似蛋白在细菌攻击及Pinctada fucata异源移植物相关免疫反应中的功能特性研究

《Aquaculture》：Functional characterization of PfTLR4-like during bacterial challenge and xenogeneic graft-associated immune responses in Pinctada fucata

　　

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  PfTLR4-like是一种属于TLR家族的分子，它来自Pinctada fucata。
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  重组的PfTLR4-like LRR结构域在体外能够与LPS、PGN和细菌结合。
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  PfTLR4-like在异源的HEK293T细胞中与PfMyD88相关联。
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  PfTLR4-like和PfMyD88在HEK293T细胞中能够增强NF-κB报告基因的活性。
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  PfTLR4-like与异种移植相关的免疫反应有关。

引言

先天免疫是无脊椎动物抵御微生物入侵的主要防御机制。模式识别受体（PRRs）能够检测到保守的病原体相关分子模式（PAMPs），并启动下游的免疫信号级联反应，最终促进免疫效应分子的表达（Brennan等人，2018年；Janeway和Medzhitov，2002年）。Toll样受体（TLRs）是研究最广泛的PRR家族之一，在病原体感知、炎症调节和免疫稳态中发挥重要作用（Iwasaki和Medzhitov，2004年；Brennan等人，2018年；Kawai等人，2024年）。对水生动物的研究表明，TLR/NF-κB相关的信号通路与先天免疫和炎症反应有关（Qian等人，2025年）。从结构上看，典型的TLR包括一个参与配体结合的胞外亮氨酸富集重复（LRR）区域、一个跨膜区域以及一个介导下游信号转导的胞内Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域（Kawasaki和Kawai，2014年；Brennan等人，2018年；Li等人，2025年）。在TLR超家族中，TLR4是脊椎动物中研究较为透彻的PRR，而TLR4-like分子在双壳类动物中的进化关系和生物学功能尚不完全清楚。TLR4或TLR4-like基因已在多种软体动物中被发现，包括Onchidium reevesii、Ruditapes philippinarum、Crassostrea hongkongensis、Pinctada fucata martensii以及选定的扇贝品系“Hongmo No. 1”（Xiao等人，2024年；Qiu等人，2025年；Yu等人，2023年；Wu等人，2017年；Yue等人，2024年）。这些蛋白质通常保留了典型的TLR结构特征，包括胞外LRR区域和胞内TIR结构域，尽管不同软体动物之间的序列存在显著差异。先前的研究表明，胞外LRR区域可以参与与微生物成分的相互作用。例如，Sinonovacula constricta的重组LRR区域在体外能够与LPS、PGN和甘露聚糖结合（Wang等人，2024年）。然而，与其他软体动物的TLR相比，双壳类动物中的TLR4-like分子的功能特性仍然知之甚少。

TLR相关的MyD88/NF-κB信号通路已在多种水生动物中被研究，尽管其分子组织和功能输出可能因进化谱系而异。在鱼类中，TLR4/NF-κB相关的信号通路与鳃部的炎症反应和组织损伤有关（Xu等人，2024年）。在双壳类动物中，MyD88相关的信号通路也与病原体感染引起的免疫反应有关。例如，C. hongkongensis中的TLR4/MyD88相关信号通路与弧菌感染引起的免疫反应相关（Chen等人，2022年；Yu等人，2023年），而在地中海贻贝M. galloprovincialis中，也报道了涉及TLR4和MyD88的免疫反应（Parisi等人，2022年）。NF-κB/Rel转录因子是先天免疫信号通路的重要调控组分（Huang等人，2021年）。在珍珠贝P. fucata中，已经克隆并表征了几种NF-κB相关蛋白，包括PfRel、PfIKK和poIκB（Wu等人，2007年；Xiong等人，2008年；Zhang等人，2009年），并且PfRel参与了NF-κB相关的转录调控（Sun等人，2015年）。然而，尚不清楚PfTLR4-like在免疫挑战期间是否与PfMyD88/PfRel相关的信号通路具有功能关联。

除了病原体相关的免疫反应外，TLR相关的信号通路还可能参与组织损伤和无菌炎症反应（Braza等人，2016年）。因此，微生物挑战和异种移植相关的组织损伤代表了不同的免疫环境，但这些环境可能部分依赖于共同的TLR相关的先天免疫机制。珍珠移植涉及手术损伤、供体外套膜的植入以及随后的局部免疫和炎症反应（Mariom等人，2019年；Wang等人，2017年；Wu等人，2022年）。异种移植可能引发与同种移植不同的免疫反应，因为供体和受体组织来自不同的物种（Wei等人，2017年；Wang等人，2025年）。先前的研究报道了珍珠贝在核插入或移植刺激后TLR家族基因的表达发生变化，PfTLR13也与移植相关的免疫反应有关（Wu等人，2017年；Bai等人，2023年）。异种移植因子-1（AIF-1）是一种进化上保守的Ca²⁺结合蛋白，与炎症和免疫反应有关（Liu等人，2007年）。在软体动物中，AIF-1参与了多种免疫相关过程。P. marrensii中的AIF-1表达对细菌挑战和组织损伤有响应（Li等人，2013年），而在Hyriopsis cumingii中，AIF-1表达对免疫挑战和珍珠囊形成期间的外套膜植入有响应（Li等人，2016年）。在Mytilus galloprovincialis中，AIF-1》也与弧菌感染后的炎症反应有关（Parisi等人，2022年）。这些研究表明，软体动物的AIF-1对微生物和组织相关的免疫刺激都有响应。然而，AIF-1表达的变化是否与异种外套膜移植期间的TLR/MyD88相关信号通路具有功能关联尚不清楚。

P. fucata是一种具有重要经济价值的海洋双壳类动物，广泛用于珍珠养殖（Mariom等人，2019年；Zheng等人，2024年）。尽管TLR相关的信号通路与病原体相关的先天免疫反应和组织损伤相关的无菌炎症有关（Akira等人，2006年；Braza等人，2016年），但PfTLR4-like在这些不同免疫环境中的参与机制仍不完全清楚。在本研究中，我们从小珠贝P. fucata中克隆并表征了一个TLR家族基因，将其命名为PfTLR4-like。我们研究了其结构特征、在异源细胞系统中的组织分布和亚细胞定位、对细菌和PAMP刺激的转录反应、其重组LRR结构的体外结合特性，以及其与PfMyD88/PfRel相关信号通路的潜在功能关联。我们还利用Pteria penguin供体组织研究了PfTLR4-like的表达及其在异种外套膜移植过程中的影响。这项研究为PfTLR4-like在珍珠贝的细菌挑战和异种移植相关免疫反应中的作用提供了额外的证据。

章节片段

动物培养、免疫刺激和样本收集

从中国广东省湛江市琉璃港沿海地区收集了一岁半的P. fucata和P. penguin。将这些贝类运输到实验室后，将它们在26±1°C和30±1盐度的循环海水系统中适应7天，并持续通气。只有壳完好无损且生理活动正常的个体被用于后续实验。为了研究PfTLR4-like转录本的组织分布，我们选取了七种组织：

PfTLR4-like的序列鉴定和系统发育分析

从P. fucata中克隆了一个TLR家族基因，并将其命名为PfTLR4-like。PfTLR4-like的GenBank登录号为PZ287633。PfTLR4-like的全长cDNA为2706 bp，包含一个2589 bp的开放阅读框，编码862个氨基酸的蛋白质（图1A）。物理化学分析预测其理论分子量为99.87 kDa，等电点（pI）为7.90。保守结构域分析显示了典型的TLR结构特征，包括N端的...

讨论

TLR广泛分布于无脊椎动物中，显示出显著的结构和进化多样性。双壳类动物的TLR谱系特别丰富和多样化，许多成员仍然保留了典型的胞外LRR区域、跨膜区域和胞内TIR结构域（Saco等人，2023年；Li等人，2025年）。在这项研究中，我们鉴定并功能表征了来自珍珠贝P. fucata的TLR家族成员PfTLR4-like。

结论

总之，PfTLR4-like被鉴定为P. fucata中的一种TLR家族成员，它对细菌挑战和PAMP刺激有响应，并与异种移植相关的免疫反应有关。RNAi、Co-IP和DLR的结果支持PfTLR4-like与PfMyD88/PfRel相关信号通路的潜在功能关联，而重组的LRR结构域在当前实验条件下表现出对细菌PAMPs的结合活性。这些发现表明...

CRediT作者贡献声明

Xiuxiu Sang：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析。Chengzhi Peng：可视化、研究。Pei Wang：可视化、方法学、概念化。Dongshuai Fan：可视化、研究。Ying Guo：可视化、研究。Mingli Qi：可视化、研究。Liumi Wei：可视化、研究。Dahui Yu：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本手稿报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中央政府科技发展专项资金（GK ZY21195020）、广西自然科学基金（2021GXNSFAA075008）、广西海洋环境灾害过程与生态保护技术重点实验室的支持。

Xiuxiu Sang|Chengzhi Peng|Pei Wang|Dongshuai Fan|Ying Guo|Mingli Qi|Liumi Wei|Dahui Yu|Lirong Bai