H1N1诱导仔猪肺热咳喘综合征探索性模型的建立及其临床表型、病理与PI3K–Akt相关分子特征

《Veterinary Sciences》：Establishment and Characterization of a Piglet Model for Pulmonary Heat-Induced Cough and Asthma Syndrome

猪肺热咳喘综合征主要由病毒、细菌及其他病原混合感染引起，以肺失宣降和肺热内蕴为特征，典型临床体征包括发热、咳嗽、脓性鼻液和呼吸困难。为构建模拟其临床特征的探索性模型，研究人员将12头健康仔猪随机分为对照组（mock感染）和三个流感A病毒H1N1（Influenza A virus subtype H1N1）感染组（高、中、低剂量病毒攻击）。三个攻击组仔猪经鼻接种高、中、低剂量H1N1流感病毒，对照组经相同途径接种DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）模拟感染。实验全程监测临床症状。感染后第8天（dpi），采集心、肝、脾、肺、肾、气管及各肠段样本，进行组织病理学观察和病毒载量检测。研究人员开展疾病靶点富集分析以筛选H1N1感染后肺组织核心靶点，并通过Western blot（蛋白免疫印迹）进一步验证结果。H1N1感染诱导仔猪出现发热、脓性鼻液、咳嗽、呼吸困难、采食量下降、平均日增重降低、饲料转化率升高和精神沉郁等典型症状。气管、肺、肝和肾可见明显病理病变，气管和肺组织检测到H1N1病毒。富集分析显示，磷脂酰肌醇3-激酶–蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-kinase–protein kinase B，PI3K–Akt）信号通路参与H1N1感染诱导的肺损伤进程。进一步分子检测表明，H1N1感染与PI3K–Akt信号改变相关，同时上调Class III PI3K，并伴随自噬和凋亡相关标志物变化，可能与肺损伤相关。所建立的仔猪模型大体符合中国农业农村部发布的《猪肺热咳喘综合征中兽医临床研究技术指南》中猪肺热咳喘证的诊断标准。综上，本研究建立了H1N1诱导的仔猪肺热咳喘探索性模型；观察到的表型和分子特征为后续疾病机制研究提供初步证据。

研究背景：猪呼吸道疾病是制约全球养猪业可持续发展的重要因素，其中肺热咳喘综合征（lung-heat cough and asthma syndrome，中兽医以高热、咳嗽、呼吸困难、脓性鼻液为特征的证候）发病率约10%–60%、死亡率约2%–20%，康复仔猪常生长迟缓、饲料转化效率下降，造成显著经济损失。该综合征可由单一或多病原及环境应激等共同诱发；中兽医理论认为其核心病机为外邪侵袭、肺热内蕴、肺失宣降、肺气上逆。经典方药有较好临床效果，但缺乏能准确反映其病理特征、临床相关且探索性的动物模型，成为制约机制研究和药效评价的技术瓶颈。H1N1（Influenza A virus subtype H1N1）具有跨物种传播能力，可致仔猪高热、咳嗽和呼吸窘迫，并引起肺部强烈炎症，与肺热咳喘综合征临床表现接近，故研究人员以H1N1单病原在受控条件下建模，系统评估临床表型、组织病理和分子调控特征。

研究人员将12头28日龄健康断奶仔猪随机分为对照组（mock感染）及H1N1高、中、低剂量感染组，滴鼻接种后观察临床症状，于感染后第8天（dpi）采集心、肝、脾、肺、肾、气管及各肠段，进行组织病理和病毒载量检测；并通过疾病靶点富集分析筛选肺组织核心靶点，用Western blot验证。结论是H1N1感染可复制仔猪肺热咳喘综合征的典型症状和病理损伤，模型大体符合中国农业农村部发布的《猪肺热咳喘综合征中兽医临床研究技术指南》诊断标准；PI3K–Akt信号、Class III PI3K、自噬和凋亡相关标志物发生改变，为后续机制研究提供初步证据。其意义在于建立“病原–证候–分子机制”整合研究范式，为猪呼吸道疾病机制、监测、早期诊断和防控策略提供探索性平台，但模型用于中兽药、疫苗和免疫调节剂临床前评价仍需验证。

关键技术方法（≤250字）：H1N1毒株CVCC AV1522经MDCK细胞扩增，滴度10^7.83 TCID₅₀/0.1 mL；12头28日龄健康断奶仔猪购自Jinzhong Xuhong Livestock Breeding Service Co., Ltd（Jinzhong, Shanxi, China），适应7天后随机分为对照组（DMEM）和高、中、低剂量H1N1组（2×10⁸、2×10⁷、2×10⁶ TCID₅₀），每组n=3，滴鼻接种2 mL。每日记录体温、临床症状、采食和体重；dpi 8安乐死，采集心、肝、脾、肺、肾、气管及各肠段，行HE（hematoxylin–eosin）染色组织病理评分；qPCR（quantitative real-time PCR）检测H1N1 M基因病毒载量；用GeneCards、STRING、Venny 2.1.0和DAVID进行疾病靶点筛选及GO/KEGG富集；Western blot检测PI3K–Akt、自噬和凋亡相关蛋白。

研究结果：3.1 临床表现：通过每日体温和症状评分观察，H1N1感染仔猪出现脓性鼻液、鼻镜干燥、干粪和尿量减少；高剂量组见白色脓性鼻液、被毛粗乱、眼睑水肿、食欲下降和嗜睡。高剂量组体温持续升高并于dpi 4超过40.3 °C，低剂量组也明显发热，中剂量组发热延迟；高剂量组症状评分最高并于dpi 4达峰，对照组接近零，高剂量组与对照组在dpi 4差异显著。3.2 生长性能：通过试验期采食和体重记录计算ADG（average daily gain，平均日增重）、ADFI（average daily feed intake，平均日采食量）和FCR（feed conversion ratio，饲料转化率），感染组从dpi 5起采食下降；高剂量组ADG较对照下降42%、ADFI下降11%、FCR升高47%，中剂量组分别下降39%、6%、升高59%，低剂量组分别下降23%、6%、升高24%，表明模型生长性能受损、生产成本增加。3.3 剖检与组织病理学发现：3.3.1 器官指数：通过dpi 8器官称重计算器官指数，心、肝、脾、肾无显著组间差异；中剂量组肺器官指数显著低于对照、高剂量和低剂量组，低剂量组显著高于中剂量组。3.3.2 对肺、气管和心脏的影响：通过大体观察和HE染色，感染组肺弹性下降、局灶性实变、灰白病灶和出血点；高剂量组肺泡结构消失、间质增宽、肺泡腔含中性粒细胞和红细胞渗出，肺和气管病理评分显著高于对照；高、中剂量组气管黏液腺增大增多，低剂量组纤毛柱状上皮鳞状化生；心脏无明显组织病理异常。3.3.3 对肝、脾、肾的影响：通过大体和HE观察，肝、脾、肾无明显大体病变，但感染组肝组织出血，高、中剂量组肾小球肿胀、鲍曼囊腔变窄和炎细胞浸润，低剂量组亦见肾小球肿胀和囊腔变窄；高剂量组肝、肾病理评分显著高于对照。3.3.4 对十二指肠、空肠、回肠的影响：通过肠道大体和HE观察，H1N1感染对小肠组织无显著影响，各组十二指肠绒毛排列整齐、肠腺丰富，空肠绒毛高密指状，回肠绒毛较短稀疏并见集合淋巴小结。3.3.5 对盲肠、结肠、直肠的影响：通过HE观察，H1N1感染对大肠组织无显著影响，各组盲肠固有层肠腺密集整齐，结肠无绒毛结构、腺体长直、腔隙宽，直肠肠腺较短、黏膜下结缔组织较致密。3.4 仔猪器官病毒载量：通过qPCR检测各器官H1N1 M基因，病毒仅见于肺和气管组织且基因组拷贝数较低，心、肝、脾、肾及十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠未检出，提示观察期内感染主要局限于呼吸系统。3.5 与肺热咳喘综合征相关靶点筛选及KEGG/GO富集分析：通过GeneCards检索发热、咳嗽、黏液和呼吸困难相关靶点，经STRING映射为猪并构建PPI（protein–protein interaction，蛋白–蛋白相互作用）网络，Venny分析获得2213个共有靶点；GO和KEGG富集显示“Pathways in cancer”富集最显著，PI3K–Akt信号通路和MicroRNAs in cancer等亦富集；GO主要涉及细胞增殖、代谢和应激反应等生物过程，细胞组分主要为细胞外空间和细胞膜，分子功能主要为蛋白结合和酶结合。分析提示PI3K–Akt是连接自噬和凋亡的关键调控轴。3.6 Western blot分析结果：通过Western blot检测肺组织蛋白，三个感染组Class III PI3K均显著升高；高、低剂量组LC3B-II/LC3B-I比值显著升高，高剂量组最明显，中剂量组无显著差异；高、低剂量组p-AKT/total AKT比值显著降低，中剂量组无显著差异，高、中剂量组总AKT显著降低；高剂量组Bax/Bcl-2比值显著升高，高、中剂量组Caspase-9升高；Caspase-8激活、Caspase-4上调提示外源性凋亡和非经典炎症小体活化，高、低剂量组cleaved Caspase-3上调。结果提示H1N1感染伴随PI3K III上调、PI3K–Akt轴改变及多条凋亡通路激活，并与自噬诱导和肺组织损伤同时出现。

讨论总结：研究人员认为，建立具有临床相关病理特征的探索性仔猪肺热咳喘综合征模型是突破猪呼吸道疾病研究瓶颈的关键；H1N1因跨物种感染、靶向呼吸道上皮、引起强烈肺部炎症及凋亡/自噬失调，可模拟“外邪侵袭→肺热内蕴→肺络损伤”的关键病理进程，且病毒主要定位于肺和气管，符合呼吸系统为主的病理特征。模型复现了发热、咳嗽、脓性鼻液、呼吸困难、鼻镜干燥、精神沉郁和采食下降，症状严重程度总体呈剂量相关趋势；生长性能受损，剖检见局灶性肺实变、出血、肺泡结构破坏、肺间质增宽和气管黏膜损伤；尽管心、肝、脾、肾和胃肠道未检出病毒，肝、肾仍见病理变化，与“热邪内传”认识相符。分子层面，PI3K–Akt通路改变、Class III PI3K升高和LC3B-II/LC3B-I升高与自噬体生成一致，凋亡通路激活可能与抑制作用减弱有关。作者也指出样本量小（每组n=3）、仅dpi 8单时间点采样、全肺匀浆Western blot不能定位细胞类型、公共数据库预测需体外验证、未进行细菌筛查等局限。研究结论翻译：本研究建立并表征了H1N1诱导的仔猪肺热咳喘综合征探索性模型；模型表现出典型临床表现、生长性能受损以及与中兽医关键诊断特征一致的肺部病理病变，并观察到PI3K–Akt信号、自噬相关标志物和凋亡相关蛋白改变；这些发现为剖析该病机制提供初步实验证据，仍需更大样本和额外验证确定模型的可重复性和适用性。