基于光学与生物力学角膜组织匹配的双交联水凝胶用于角膜基质无细胞重塑

《Bioactive Materials》：An optically and biomechanically corneal tissue-matched dual-crosslinkable hydrogel for cell-free remodeling of the corneal stroma

　　

摘要专业翻译 开发出兼具光学透明性与生物力学组织匹配性的双交联水凝胶，其性能与天然角膜相当。该水凝胶基于氧化甲基丙烯酰化透明质酸（oxidized hyaluronic acid methacryloyl，OHAMA）与甲基丙烯酰化明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）构建，通过动态席夫碱交联与光交联双重机制形成网络。该水凝胶可在原位形成，实现深部角膜基质的无细胞重塑。动态交联与光交联的协同作用改善了组织整合性与稳定性。负载阳离子抗菌肽HHC36（KRWWKWWRR）后，水凝胶展现出强效抗菌活性，可根除感染并减轻角膜纤维化。在兔深部角膜缺损及铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染模型中，该水凝胶实现了功能性角膜重塑，显著减少瘢痕形成，并有效抑制炎症反应。研究结果表明，该双交联水凝胶作为一种光学与生物力学组织匹配的原位可注射支架，在角膜创伤修复与感染性角膜病变治疗中具有重要临床应用潜力。

论文解读文章

研究背景与问题

中度至重度的角膜损伤和感染是导致视觉功能障碍和失明的主要原因。此类损伤常累及角膜基质层，愈合过程中易发生基质纤维化，导致角膜瘢痕和混浊，显著降低角膜透明度和屈光力。目前临床主要治疗策略包括药物治疗、角膜移植和干细胞治疗。药物治疗虽可促进伤口愈合，但难以实现组织的有序重建和瘢痕预防；干细胞治疗多处于临床前阶段，受限于干细胞来源；角膜移植虽为严重创伤的最终治疗手段，但供体角膜短缺严重制约其应用。因此，开发新型角膜替代物以克服现有治疗策略的局限性，是亟待解决的临床需求。

近年来，水凝胶基角膜替代物取得了显著进展，如聚乙二醇（PEG）水凝胶（ReSure?和OcuSeal?）已获临床批准，GelMA光交联水凝胶GelCORE展现出良好角膜粘附性和基质再生能力。然而，现有水凝胶在光学性能、生物力学特性与天然角膜组织之间仍存在不匹配，常导致角膜再生效果不佳。理想的角膜替代物应具备可见光透明性、适当屈光力，以及接近天然角膜的生物力学性能，以维持角膜曲率和承受眼内压（IOP）。此外，静态水凝胶虽具有稳定网络结构，但难以匹配天然角膜的动态生物力学特性。因此，开发兼具光学与生物力学组织匹配性、且能适应角膜动态微环境的原位可注射水凝胶，是该领域的关键挑战。

研究内容与结论

针对上述问题，研究人员基于氧化甲基丙烯酰化透明质酸（OHAMA）和甲基丙烯酰化明胶（GelMA），通过整合动态席夫碱交联与静态光交联，构建了一种光学与生物力学角膜组织匹配的原位双交联水凝胶，用于角膜基质的无细胞重塑。通过调控OHAMA含量，系统优化了水凝胶的光学透明度、折射率、溶胀率、含水量、降解速率、凝胶化时间、压缩强度、弹性模量及组织粘附力等关键性能。其中，G₁₀₀OH₁₀配方（100 mg/mL GelMA与10 mg/mL OHAMA）展现出最佳的综合性能平衡：光学透过率高于80%，折射率接近天然角膜，弹性模量（83.82 ± 13.43 kPa）接近天然角膜（115.30 ± 13.60 kPa），爆破压（99.75 ± 11.27 mmHg）远超生理眼内压范围，且具有良好的细胞相容性、降解行为和促细胞迁移能力。进一步负载阳离子抗菌肽HHC36后，水凝胶（HHC36@Gel）在不显著影响光学和力学性能的前提下，获得了强效且广谱的抗菌及抗生物膜活性。在兔深部角膜缺损模型中，G₁₀₀OH₁₀水凝胶促进了角膜上皮成熟、基质胶原有序重塑和神经修复，并通过抑制TGF-β介导的病理性细胞外基质（ECM）重塑减少瘢痕形成。在铜绿假单胞菌感染的深部角膜缺损模型中，HHC36@Gel²（2 mg/mL HHC36）展现出与临床左氧氟沙星（LVX）相当的抗菌效果，同时更有效地抑制了促炎细胞因子表达和炎性细胞浸润，促进了无瘢痕的角膜基质重塑。该研究为严重角膜创伤及感染性角膜病变提供了一种有前景的无细胞治疗策略，相关成果发表于《Bioactive Materials》。

关键技术方法

研究人员采用以下主要关键技术方法开展研究：通过化学修饰合成OHAMA与GelMA，利用核磁共振氢谱（¹H NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）表征其结构；采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼光谱验证双交联网络形成；使用光流变仪测定凝胶化时间与储能模量；通过扫描电子显微镜（SEM）观察微观孔隙结构；采用万能试验机测定压缩强度、弹性模量及粘附力；通过CCK-8、活/死染色及划痕实验评估细胞相容性与迁移能力；利用体外药物释放实验和抗菌活性实验（IC₅₀、菌落计数、活/死染色、SEM、结晶紫染色）评价HHC36释放行为及抗菌/抗生物膜效果；在兔深部角膜缺损及铜绿假单胞菌感染模型中，结合裂隙灯、眼前节光学相干断层扫描（AS-OCT）、角膜内皮镜、组织学染色（H&E、Masson）、透射电子显微镜（TEM）、免疫荧光染色及转录组学分析，全面评估水凝胶的体内疗效与安全性。

研究结果

2.1 水凝胶基替代物的理性设计、制备与表征

通过调控OHAMA含量，制备了G₁₀₀OH₅、G₁₀₀OH₁₀和G₁₀₀OH₂₀三种水凝胶。FTIR和拉曼光谱证实了席夫碱（C=N）与甲基丙烯酰基自由基聚合（C=C）形成的双交联网络。所有水凝胶在500–800 nm波长范围内光学透过率均高于80%，折射率随OHAMA含量增加而降低。水接触角、溶胀率、含水量及降解速率均随OHAMA含量增加而降低，而压缩强度、弹性模量、粘附力和爆破压则随之升高。G₁₀₀OH₁₀水凝胶的弹性模量接近天然角膜，爆破压远超生理眼内压范围，表明其具备良好的生物力学匹配性和组织粘附性。

2.2 水凝胶基替代物的体外生物相容性与细胞迁移能力

CCK-8实验表明所有水凝胶提取物均无细胞毒性。二维培养中细胞活力维持在90%以上，三维培养中G₁₀₀OH₁₀在培养第5天维持较高的细胞数量。划痕实验显示G₁₀₀OH₁₀水凝胶对HCEC细胞迁移的促进作用最强。综合评估后，G₁₀₀OH₁₀因其在光学透明度、角膜匹配力学性能、细胞相容性、降解行为、组织粘附及细胞迁移支持方面的最佳平衡，被选用于后续体内研究。

2.3 G₁₀₀OH₁₀水凝胶促进兔深部角膜缺损模型中的角膜基质重塑

在兔深部角膜缺损模型中，裂隙灯检查显示G₁₀₀OH₁₀水凝胶在第7天实现完全角膜上皮化，第90天角膜混浊程度较模型组显著减轻。AS-OCT显示水凝胶有效填充缺损并贴合角膜曲率。角膜内皮镜检查证实水凝胶植入未对内皮细胞密度和形态产生不良影响。Masson染色和TEM显示水凝胶组在第90天呈现有序的基质胶原层状排列，接近正常角膜结构。TUBB3免疫荧光染色表明水凝胶促进了损伤角膜神经的修复。转录组学分析显示水凝胶组下调了纤维化相关基因（如TGFB2、LTBP4、PDGFA、COL10A1），并富集于ECM-受体相互作用和TGF-β信号通路。免疫荧光染色进一步证实水凝胶组增强了CK3和ZO-1表达，同时降低了TGF-β、α-SMA和vimentin的表达，表明其促进上皮成熟和屏障恢复，同时抑制基质纤维化。

2.4 HHC36负载水凝胶的理性设计、体外释放行为及抗菌效果

HHC36在G₁₀₀OH₁₀水凝胶中的包封效率为80.38 ± 2.22%。体外释放实验显示，OHAMA含量增加可延长HHC36的持续释放时间，G₁₀₀OH₁₀水凝胶可持续释放至418小时。HHC36对金黄色葡萄球菌（S. aureus）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、大肠杆菌（E. coli）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的IC₅₀值分别为8.076、9.774、22.790和29.060 μg/mL。菌落计数、活/死染色和SEM实验证实HHC36@Gel显著抑制细菌生长并破坏细菌膜完整性。结晶紫染色显示HHC36@Gel有效抑制生物膜形成。HHC36在模拟眼液环境中短期保持活性，冻干储存三个月后结构和活性均保持稳定。

2.5 HHC36@Gel²促进铜绿假单胞菌感染的深部角膜缺损的角膜基质重塑并减少瘢痕形成

在兔铜绿假单胞菌感染的深部角膜缺损模型中，HHC36@Gel²组在第30天角膜透明，无新生血管形成，与左氧氟沙星联合水凝胶（Gel + LVX）组效果相当。第7天细菌菌落计数显示HHC36@Gel²显著降低细菌负荷。角膜内皮镜检查显示治疗组内皮细胞密度和形态接近正常。H&E和Masson染色显示HHC36@Gel²组角膜结构近正常，胶原纤维排列有序。转录组学分析显示HHC36@Gel²下调了炎症相关基因（如TNF、IL1B、CCL2、ICAM1）和纤维化相关基因（如TGFB2、MMP1、MMP3）。免疫荧光染色证实HHC36@Gel²较Gel + LVX更有效地抑制了TNF-α、IL-1β、MMP-9表达及CD11b⁺和CD68⁺炎性细胞浸润，同时显著降低α-SMA和vimentin表达。

2.6 G₁₀₀OH₁₀水凝胶的体内生物安全性

术后第90天，对心、肝、脾、肺、肾主要器官进行H&E染色，结果显示水凝胶组各器官组织结构完整、细胞形态正常，无变性、坏死或炎性细胞浸润，表明水凝胶长期体内滞留未引起可检测的毒性，具有良好的生物安全性。

讨论与结论

该研究通过整合动态席夫碱交联与静态光交联，成功构建了光学与生物力学角膜组织匹配的双交联水凝胶。G₁₀₀OH₁₀配方在光学透明度、力学性能、降解行为、细胞相容性和组织粘附性之间实现了最佳平衡。负载HHC36后，水凝胶兼具强效抗菌和抗炎活性，同时保持原有光学和力学性能。体内研究表明，该水凝胶不仅填充角膜缺损、防止感染，还能通过抑制TGF-β介导的纤维化信号通路和过度炎症反应，促进有序的基质胶原重塑和神经修复，减少瘢痕形成。动态席夫碱键赋予水凝胶自适应微环境的能力，而低剂量HHC36负载在保持网络结构稳定的同时实现持续抗菌释放。该研究为严重角膜创伤及感染性角膜病变提供了一种无细胞、可注射、光学与力学匹配的原位水凝胶治疗策略，具有重要的临床转化潜力。