利用橄榄油厂废水作为生物刺激素缓解番茄植株盐胁迫并提升其营养品质

《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Mitigation of salt stress and enhancement of the nutritional content of tomato plants using olive mill wastewater as a biostimulant

　　

橄榄油厂废水（OMW）表征显示琥珀酸和肉桂酸浓度较高。叶面喷施1:4稀释（%v/v）的OMW表现出最高的生物刺激效率。通过降低MDA、H₂O₂和脯氨酸积累，氧化胁迫得到缓解。

研究背景方面，全球约7.5%的陆地面积受盐渍化影响，可溶性盐积累主要由水资源短缺、过量施肥和/或盐水灌溉引起。高盐浓度改变土壤理化性质并降低作物生产力，土壤电导率升高可抑制硝化与反硝化等关键土壤过程。根际高盐浓度因渗透势降低而阻碍根系吸水，限制幼叶和根的细胞扩展。Na⁺和Cl^-的吸收与积累通过与其他养分（如K⁺）竞争引起细胞毒性和离子失衡。盐胁迫下活性氧（ROS）积累引发氧化胁迫，促进脂质过氧化，导致细胞膜完整性丧失，最终降低作物产量。与此同时，全球人口预计到2050年从83亿增至97亿，园艺生产面临增产压力，对化学投入品的依赖可能增加，导致生产成本上升及对健康和环境的潜在不利影响。因此，基于农工业副产物增值和循环经济原则的可持续策略日益受到关注。生物刺激素被定义为施用于植物以提高养分效率、非生物胁迫耐受性和/或作物品质性状的任何物质或微生物，不论其养分含量如何。橄榄油厂废水（OMW）是橄榄油提取过程中产生的副产物，富含酚类化合物，仅1-2%的酚类化合物转移至油中，约53%保留在废水中。OMW中已鉴定出多种酚酸，包括肉桂酸、p-香豆酸、琥珀酸、咖啡酸、阿魏酸、香草酸、没食子酸和丁香酸，其中羟基酪醇为主要成分，占总酚类组分的70%。全球每年产生约6×10⁶ m³的OMW，其中约98%产生于西班牙、希腊、葡萄牙和意大利。然而，该废物难以处理，直接排放至土壤可引起环境问题。因此，OMW的农业再增值可能代表一种可持续的循环经济策略。近年来，越来越多的研究关注从OMW中回收高附加值化合物。在农业领域，已有研究评估了OMW作为生物肥料、生物农药以及缓解石榴盐胁迫的酚类提取物的应用。尽管有这些应用，OMW作为生物刺激素缓解盐度和干旱等非生物胁迫的研究在文献中仍涉及较少。虽然已有报道OMW在番茄和大麦干旱和盐胁迫条件下的生物刺激效应，但两项研究中OMW均通过根系施用，而其作为叶面处理的应用尚未被研究。基于此背景，本研究以番茄为模式作物，番茄是全球种植和消费最广泛的园艺作物之一，2022年约4万公顷产量约400万吨，其经济重要性和公认的营养价值使其成为评估非生物胁迫条件下新型生物刺激素策略的合适模式作物。本研究的主要目标是表征OMW并评估其作为叶面施用生物刺激素缓解番茄盐胁迫的有效性，同时评估两种施用浓度以确定最大化其有益效应的浓度。
研究人员开展的研究方面，OMW采集自西班牙阿利坎特Cocentaina的"Oli del Comtat"油厂，来源于2023年10月至12月收获的三个橄榄品种（Alfafarenca、Blanqueta和Manzanilla）的橄榄油提取过程。样品在4°C下储存两个月后进行理化表征，使用中速滤纸真空过滤调理。番茄植物（Solanum lycopersicum L., cv. Cherry）在环境培养箱中控制条件下生长，种子在硅砂中发芽，14天后将32株至少10 cm高的幼苗移植到水培系统。植物在移栽后21天（DAT）于阿利坎特大学温室中生长，控制环境条件为18/25°C（夜/昼）、60%相对湿度和16/8 h光/暗光周期。营养液初始EC为2 dS m^-1，盐胁迫处理添加NaCl至终浓度50 mM，EC增至8 dS m^-1。根据Zhu等（2004）的建议选择叶面施用浓度。本研究中OMW的TPC为371±12 mg GAE L^-1，为避免植物毒性效应，制备两种稀释溶液：OMW-4（1:4，%v/v，92.8 mg GAE L^-1）和OMW-2（1:2，%v/v，185.5 mg GAE L^-1）。叶面处理在7和14 DAT时通过每株喷洒5 mL相应溶液进行。实验设计包括四个处理：（i）非盐对照（NC），标准营养液生长并喷洒5 mL蒸馏水；（ii）盐对照（SC），盐胁迫（8 dS m^-1，50 mM NaCl）并喷洒5 mL蒸馏水；（iii）OMW-4，盐胁迫植物接受5 mL 1:4（%v/v）OMW稀释液；（iviv）OMW-2，盐胁迫植物接受5 mL 1:2（%v/v）OMW稀释液。每个处理进行8个生物学独立重复，温室实验在单一技术重复中进行。在营养生长期结束（播种后35天）收获植物，测量鲜重（FW）和干重（DW），总叶绿素含量按Abadía等（1984）方法测定。叶片样品研磨后微波消解，通过ICP-MS测量大量元素（K、Na、Mg、Ca）（% DW）和微量元素（Zn、Cu、Mo、Mn、Fe）（mg kg^-1 DW）浓度。MDA浓度按Singh等（2007）方法测定，H₂O₂含量按Kuk和Shin（2007）方法测定，电解质泄漏按Restrepo等（2013）方法估算膜通透性，脯氨酸含量按Magné和Larther（1992）方法测定。统计分析使用IBM SPSS^? Statistics（25.0版），采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，p≤0.05认为差异显著。
研究结果方面，3.1 OMW滤液的主要特性：OMW理化表征显示酸性pH（4.63±0.06）和中等电导率（3.51±0.02 dS m^-1），TOC为500±50 mg L^-1，TPC为371±12 mg GAE L^-1，抗氧化活性为9.33±0.19 μmol TE mL^-1。大量元素Ca、K、Mg和Na浓度分别为39.5、385、35.7和8.24 mg L^-1，微量元素Mn、Zn、Fe和Cu分别为0.289、0.51、2.029和0.163 mg L^-1。重金属Cr、Pb、Hg和Cd均低于检测限，Ni为0.056 mg L^-1，远低于欧盟法规2019/1009的50 mg kg^-1干物质阈值。HPLC分析确认OMW中存在多种次生代谢物，主要为酚酸类，琥珀酸浓度最高（11.60±0.96 mg L^-1），其次为肉桂酸（1.03±0.09 mg L^-1）、香草酸（0.96±0.08 mg L^-1）、咖啡酸（0.36±0.04 mg L^-1）、4-羟基苯甲酸（0.28±0.02 mg L^-1）、p-香豆酸（0.16±0.02 mg L^-1）、丁香酸（0.058±0.005 mg L^-1）、奎尼酸（0.047±0.003 mg L^-1）和原儿茶酸（0.031±0.002 mg L^-1）。与文献报道相比，羟基酪醇、酪醇和橄榄苦苷在本研究中未检测到，可能与橄榄油提取工艺中加水影响酚类化合物在水相中的分布和回收有关，Folin-Ciocalteu法的非特异性和HPLC分析的靶向性也可能导致TPC与HPLC定量酚类化合物之间的差异，4°C储存两个月也可能影响酚类谱。总体而言，理化与化学表征表明OMW含有矿质养分和生物活性化合物，符合欧盟植物生物刺激素法规的最大允许阈值。3.2 OMW生物刺激素对植物生长、叶绿素含量和矿质浓度的影响：盐胁迫显著降低植物生长，FW和DW均下降。叶面施用OMW部分缓解了这一降低，与SC相比，OMW-4和OMW-2的FW分别增加34%和8%，OMW-4处理在盐胁迫植物中FW最高，但仍显著低于NC。DW在OMW-4和OMW-2中分别增加约24%和25%，两处理间无显著差异。盐胁迫下植物总叶绿素浓度降低31%，叶面喷施OMW使叶绿素水平较SC提高15%（OMW-4）和21%（OMW-2），两处理间无显著差异，但均未能达到NC水平。盐胁迫显著影响番茄叶片大量元素组成，NC植物叶片Ca²⁺浓度是SC的1.6倍，OMW-4和OMW-2均促进Ca²⁺吸收，OMW-2（增加38%）比OMW-4（增加24%）更有效。Mg呈现类似模式，NC植物叶片Mg浓度是SC的1.6倍，OMW-2增加41%为最高。NC植物叶片K⁺含量比SC高50%，OMW-4处理与NC无显著差异，可能减少了盐介质中K⁺与Na⁺的竞争，OMW-2较SC增加29%的K含量。Na含量方面，OMW-2与SC无显著差异，OMW-4较SC显著增加16%。微量元素中仅Cu和Zn显示显著差异，Cu从NC的0.90 mg kg^-1增至OMW-2的1.17 mg kg^-1，Zn从25增至OMW-4的39 mg kg^-1，Mn和Fe无显著差异。这些改善表明OMW施用后植物性能在盐条件下部分恢复，较低稀释度通常对植物生长和叶绿素含量影响更强。OMW中高浓度琥珀酸可能与其生物刺激活性相关，琥珀酸可减少ROS积累和细胞损伤，降低Na⁺积累，促进侧根增殖。3.3 OMW施用对H₂O₂、MDA、电解质泄漏和脯氨酸浓度的影响：盐胁迫显著增加番茄植株ROS积累，SC植物H₂O₂浓度高于NC。叶面施用OMW使OMW-4和OMW-2的H₂O₂浓度较SC分别显著降低35%和32%，两OMW处理的H₂O₂浓度与NC无显著差异。MDA方面，盐胁迫导致最高MDA浓度，叶面施用OMW使OMW-4和OMW-2的MDA水平较SC分别降低43%和45%，OMW处理植物与NC间无显著差异。电解质泄漏方面，盐胁迫植物电解质泄漏约为NC的两倍，OMW-4降低43%，OMW-2降低37%，OMW-4值更接近对照。脯氨酸浓度在SC植物中约为NC的2.9倍，叶面施用OMW使OMW-4和OMW-2的脯氨酸积累较SC分别显著降低45%和36%，OMW-4值更接近NC。这些结果表明OMW叶面施用，尤其是较低剂量，可缓解番茄盐条件下的渗透胁迫。H₂O₂和MDA浓度的降低表明处理减轻了盐度相关的氧化损伤，电解质泄漏的 concomitantly降低进一步支持对膜完整性的保护作用。脯氨酸积累的减少可能反映植物感知到较轻的渗透胁迫。OMW中的酚类和其他生物活性化合物可能直接作为抗氧化剂或调节内源防御机制，但本研究未评估单个化合物对观察到的响应的贡献，具体机制无法仅从本研究结果确定。琥珀酸似乎是缓解盐胁迫最相关的有机酸，外源施用琥珀酸可降低脂质过氧化，提高叶绿素含量、叶面积和膜通透性。4. 结论：OMW表现出合适的理化和代谢组学特征，可作为番茄盐胁迫下的潜在生物刺激素。在本研究条件下，叶面施用两种OMW剂量（1:4和1:2稀释）均提高叶绿素浓度并缓解盐诱导的氧化胁迫，表现为H₂O₂、MDA、电解质泄漏和脯氨酸含量的降低。OMW-4在增加鲜重方面更有效，而OMW-2略微提高钙和其他养分吸收。这表明较低剂量似乎是本研究中的最优处理，提供最大的生长益处和盐胁迫缓解，主要归因于养分（如钾）和酚类化合物（如琥珀酸）。总体而言，这些结果表明OMW作为多功能生物刺激素，整合矿质营养和生物活性有机化合物，有助于改善生理性能和胁迫耐受性，同时支持农工业残留物的可持续增值。在此背景下，OMW中的酚类化合物和低分子量有机酸（包括琥珀酸）可能参与胁迫响应的调节，但其具体机制作用需要进一步验证。琥珀酸此前已被认为通过调节植物生理生化过程增强对生物和非生物胁迫条件的耐受性。尽管有这些结果，仍需进一步研究优化施用策略，包括频率、剂量，以及评估不同植物物种和田间条件下的响应。特别是琥珀酸的作用需要进一步研究，因为在盐胁迫条件下园艺作物上已发表的研究数量有限。此类研究将有助于巩固OMW作为盐环境下可持续和基于循环经济的农业生物刺激素的潜力。
讨论部分总结：本研究讨论了OMW作为叶面生物刺激素缓解番茄盐胁迫的效果。研究表明，OMW叶面施用减轻了盐胁迫对番茄植株的不利影响，表现为FW、DW、总叶绿素和部分大量及微量元素的改善，同时降低了氧化胁迫指标包括H₂O₂、MDA、电解质泄漏和脯氨酸，尤其在最低剂量OMW-4下效果更明显。H₂O₂和MDA浓度的降低表明处理减轻了盐度相关的氧化损伤，电解质泄漏的 concomitantly降低进一步支持对膜完整性的保护作用。脯氨酸积累的减少可能反映植物感知到较轻的渗透胁迫。OMW的保护效应可能与其酚类和其他生物活性化合物含量有关，这些化合物可能直接作为抗氧化剂或调节内源防御机制。琥珀酸似乎是缓解盐胁迫最相关的有机酸，外源施用琥珀酸可降低脂质过氧化，提高叶绿素含量、叶面积和膜通透性。然而，本研究未评估单个化合物对观察到的响应的贡献，具体机制无法仅从本研究结果确定。研究结论翻译：OMW表现出合适的理化和代谢组学特征，可作为番茄盐胁迫下的潜在生物刺激素。在本研究条件下，叶面施用两种OMW剂量（1:4和1:2稀释）均提高叶绿素浓度并缓解盐诱导的氧化胁迫，表现为H₂O₂、MDA、电解质泄漏和脯氨酸含量的降低。OMW-4在增加鲜重方面更有效，而OMW-2略微提高钙和其他养分吸收。这表明较低剂量似乎是本研究中的最优处理，提供最大的生长益处和盐胁迫缓解，主要归因于养分（如钾）和酚类化合物（如琥珀酸）。总体而言，这些结果表明OMW作为多功能生物刺激素，整合矿质营养和生物活性有机化合物，有助于改善生理性能和胁迫耐受性，同时支持农工业残留物的可持续增值。在此背景下，OMW中的酚类化合物和低分子量有机酸（包括琥珀酸）可能参与胁迫响应的调节，但其具体机制作用需要进一步验证。琥珀酸此前已被认为通过调节植物生理生化过程增强对生物和非生物胁迫条件的耐受性。尽管有这些结果，仍需进一步研究优化施用策略，包括频率、剂量，以及评估不同植物物种和田间条件下的响应。特别是琥珀酸的作用需要进一步研究，因为在盐胁迫条件下园艺作物上已发表的研究数量有限。此类研究将有助于巩固OMW作为盐环境下可持续和基于循环经济的农业生物刺激素的潜力。