超声辅助提取Mansoa alliacea花多酚的工艺优化及其抗氧化、抗炎相关与消化酶抑制活性评价

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Optimization of ultrasound-assisted extraction of polyphenols from Mansoa alliacea flowers and evaluation of their antioxidant, anti-inflammatory-related, and digestive enzyme inhibitory activities

　　

背景：Mansoa alliacea在传统上用于治疗炎症、感染及代谢紊乱，然而其花的植物化学成分与生物活性潜力尚缺乏系统表征。目的：本研究优化Mansoa alliacea花多酚的超声辅助提取（UAE）工艺，并评价优化提取物的体外抗氧化、抗炎相关及消化酶抑制活性。方法：首先通过单因素实验筛选四个提取参数（乙醇浓度、提取温度、提取时间及料液比）。基于单因素结果，选取三个关键因素（温度、时间、乙醇浓度），采用Box-Behnken设计进一步优化以获得最大多酚产量。总多酚含量采用Folin-Ciocalteu法测定。采用UHPLC-MS进行初步植物化学成分表征。对优化提取物进行体外抗氧化活性（DPPH、ABTS法）、抗炎活性（蛋白质变性抑制及红细胞膜稳定化）及消化酶抑制活性（α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶抑制）评价。结果：最佳提取条件（60%乙醇、79 °C、15 min、1:10 w/v）的多酚产量为275.37 ± 1.55 mg GAE/g提取物。UHPLC-MS分析显示9个主要色谱峰，其中2个化合物初步鉴定为木犀草素-7-O-葡萄糖苷（luteolin-7-O-glucoside）和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（luteolin-7-O-glucuronide）。与未优化提取物相比，优化提取物体外生物活性显著增强，DPPH和ABTS法的IC₅₀值分别为11.88 ± 0.28和15.58 ± 0.33 μg/mL；蛋白质变性抑制的IC₅₀为38.77 ± 0.93 μg/mL；红细胞膜稳定化的IC₅₀为30.74 ± 0.18 μg/mL；α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制的IC₅₀分别为30.94 ± 0.54和13.32 ± 0.19 μg/mL。结论：优化UAE显著提高了提取物中多酚的富集程度，并改善了Mansoa alliacea花提取物的体外抗氧化能力、对蛋白质变性和红细胞溶血的保护作用及碳水化合物水解酶抑制活性。上述发现为Mansoa alliacea的传统应用提供了初步科学依据，并提示其富含多酚的提取物可作为功能性或植物药物成分进一步研究的有前景候选物。

研究背景：Mansoa alliacea为紫葳科（Bignoniaceae）热带攀援植物，具有大蒜样气味，传统用于治疗类风湿性关节炎、炎症、疼痛及肺炎、支气管炎、咳嗽、流感等呼吸系统疾病。已有植物化学研究从其鉴定出多种生物活性成分，包括有机硫化合物（二烯丙基二硫化物、二烯丙基三硫化物、蒜氨酸、大蒜素）、甾醇（β-谷甾醇、岩藻甾醇、豆甾醇、胡萝卜苷）、环烯醚萜类、异硫氰酸酯类、萘醌类、生物碱、皂苷、黄酮类及其他多酚。多酚为一类含多个酚羟基的植物次生代谢产物，涵盖酚酸、芪类、黄酮类、单宁及木质素，因高营养价值和多样生物活性（抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒）而广泛研究。尽管全球已有大量关于Mansoa alliacea叶的植物化学与生物活性研究，但其花尤其是越南产花的研究相对匮乏。研究人员此前已优化Mansoa alliacea花富含生物碱和富含黄酮部位的超声辅助提取并证实其抗氧化、抗菌及抗肥胖等活性，但多酚是更广泛且化学上不同的类别，不仅包括黄酮还包括其他酚类成分，可能具有不同的提取行为和生物功能。迄今尚无专门优化Mansoa alliacea花富含多酚部位提取或评价其与多酚富集相关的抗炎和抗糖尿病活性的研究。因此，本研究旨在优化Mansoa alliacea花多酚的超声辅助提取并评价优化提取物的抗氧化、抗炎和抗糖尿病特性，以期为将该花提取物开发为针对氧化应激、炎症和血糖控制的功能食品或膳食补充剂成分提供依据。

研究人员开展的研究与结论：研究人员通过单因素实验考察温度、时间、乙醇浓度和料液比对多酚提取的影响，确定温度、时间和乙醇浓度为关键因素，采用Box-Behnken响应面设计优化，获得最佳条件为60%乙醇、79 °C、15 min、料液比1:10（w/v），验证实验多酚含量为275.37 ± 1.55 mg GAE/g提取物。UHPLC-MS分析检测到9个主要色谱峰，其中2个初步鉴定为木犀草素-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷。与未优化提取物相比，优化提取物表现出显著更强的体外抗氧化、抗炎相关及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究意义在于为Mansoa alliacea的传统应用提供初步科学支持，并提示其富含多酚的提取物可作为功能性或植物药物成分进一步研究。

关键技术方法：研究人员采集越南芹苴市平水郡2022年1月开花的Mansoa alliacea花，经形态学鉴定凭证标本保藏于Nam Can Tho大学医学系生物学实验室（保藏编号CT_Man202101080010）；花经60 °C热风干燥、粉碎过60目筛，含水量约7%。采用40 kHz超声辅助提取，单因素实验筛选参数后以Box-Behnken设计（Design Expert v11.0）优化；总多酚采用Folin-Ciocalteu法于765 nm测定，以没食子酸当量表示；UHPLC-MS采用Ultimate 3000系统耦合MSQ Plus单四极杆质谱仪与二极管阵列检测器，负离子电喷雾电离模式全扫描m/z 190–1500；体外抗氧化采用DPPH和ABTS法，抗炎采用蛋白质（牛血清白蛋白）变性抑制和大鼠红细胞膜稳定化实验（伦理批准号40YSH/PCT-H???），消化酶抑制采用α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制实验；统计分析采用单因素方差分析及Tukey HSD检验。

研究结果：（1）单因素实验对多酚提取的影响：温度从30 °C升至80 °C时多酚含量由117.77 ± 2.10升至151.78 ± 2.27 mg GAE/g提取物，90 °C时显著下降至145.12 ± 0.99 mg GAE/g提取物，可能与多酚热降解有关；超声时间从5 min延长至15 min产量由117.06 ± 0.60升至137.05 ± 1.15 mg GAE/g提取物，超过15 min后不再增加且20 min后略降，提示过长超声可致酚类氧化或降解；乙醇浓度从40%增至60%（v/v）时产量由145.01 ± 0.98升至161.41 ± 2.53 mg GAE/g提取物，高于60%后下降，反映多酚提取的极性需求，水-乙醇混合中等极性溶剂优于纯水或无水乙醇；料液比在1:10至1:40（w/v）范围内影响较小，差异无统计学意义（p > 0.05），故选用1:10。据此确定温度70–90 °C、时间10–20 min、乙醇浓度50–70% v/v为优化范围。（2）提取工艺优化（Box-Behnken结果）：17次实验拟合二阶多项式模型，模型显著（p < 0.05），决定系数R² = 0.9949、校正R² = 0.9884、变异系数CV = 2.98%，失拟项p = 0.0563无统计学显著性但接近0.05阈值需谨慎解读；时间与乙醇浓度线性效应显著（p < 0.05），温度线性效应不显著（p = 0.0921），三因素二次项均显著，温度×时间交互项显著（p < 0.05）；模型预测最佳条件为79.22 °C、14.55 min、60.42%乙醇，取整为79 °C、15 min、60%乙醇，预测多酚含量276.20 mg GAE/g提取物，验证实验得275.37 ± 1.55 mg GAE/g提取物，与预测吻合良好。优化条件与研究人员此前关于生物碱富集和黄酮富集提取的研究不同，提示不同植物化学类别溶剂极性需求存在差异；本研究以单位质量干提取物中多酚含量为响应变量以靶向植物化学富集而非绝对提取回收率，提取率（% w/w干花）未协同优化，属研究局限。（3）UMAE与OMAE提取物的UHPLC-MS表征：两种提取物均含9个主要色谱峰，OMAE总峰面积约为UMAE的3.51倍，提示优化主要提高可检测多酚成分的相对丰度和浓度而非实质改变整体色谱模式；峰6和峰7在OMAE中相对丰度增加最显著。峰6去质子化分子离子[M ? H]^?为m/z 447.62，源内碎片离子m/z 285.49，UV-Vis吸收峰为241.72、282.42和335.34 nm，结合保留时间11.82 min初步鉴定为木犀草素-7-O-葡萄糖苷（C₂₁H₂₀O₁₁，448.10 Da；[M ? H]^?理论值447.09，苷元碎片285.05），其在OMAE中峰面积较UMAE增加3.29倍；峰7去质子化分子离子[M ? H]^?为m/z 461.44，源内碎片离子m/z 285.15（丢失约176 Da葡萄糖醛酸基团），UV-Vis吸收峰为242.55、281.06和333.13 nm，保留时间12.59 min，初步鉴定为木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（C₂₁H₁₈O₁₂，462.08 Da；[M ? H]^?理论值461.07，苷元碎片285.05），其在OMAE中峰面积增加3.48倍。研究人员指出，由于采用单四极杆LC-MS、9个峰中7个未鉴定且未进行纯化合物分离或生物活性导向分级，将观察到的活性归因于这两种暂定黄酮尚为时过早，增强的生物活性更可能是共提取多酚复杂基质协同或加和作用的净结果。（4）体外抗氧化活性：OMAE和UMAE均呈浓度依赖性自由基清除，OMAE效力明显更高；OMAE在1 μg/mL时清除3.14 ± 0.91% ABTS•⁺，20 μg/mL时达66.16 ± 0.99%；DPPH抑制在1 μg/mL时为4.49 ± 1.15%，20 μg/mL时达84.15 ± 1.26%；UMAE需10–100 μg/mL范围才达5.98 ± 1.03%至68.06 ± 1.58%的ABTS•⁺清除及9.42 ± 2.18%至71.71 ± 1.63%的DPPH清除，表明OMAE效力更强，归因于其更高的多酚含量。（5）体外抗炎活性：OMAE和UMAE均剂量依赖性抑制热诱导BSA变性；OMAE抑制率从1.56 μg/mL时2.92 ± 0.59%增至50 μg/mL时62.70 ± 2.12%，在所测浓度范围内与双氯芬酸无统计学显著差异（p > 0.05），但研究人员强调此不应解读为多组分植物提取物与单分子参比药物的药理或治疗等效性；UMAE抑制作用弱得多（IC₅₀ = 145.69 ± 2.31 μg/mL）。红细胞保护实验中，OMAE在10 μg/mL时保护17.31 ± 2.05%红细胞免于溶血，约为UMAE（3.35 ± 1.17%）的5.17倍；50 μg/mL时保护率达80.85 ± 1.03%，与双氯芬酸无统计学显著差异（p > 0.05）；UMAE的IC₅₀为144.88 ± 3.01 μg/mL。（6）体外碳水化合物水解酶抑制活性：OMAE在1.56–50 μg/mL对α-淀粉酶抑制率为4.02 ± 0.89%至76.40 ± 3.00%，50 μg/mL时约为UMAE同浓度抑制的3.45倍；OMAE对α-葡萄糖苷酶在1 μg/mL时抑制3.72 ± 0.34%，20 μg/mL时达75.78 ± 1.59%，20 μg/mL时较UMAE强5.34倍。阿卡波糖仍是最强抑制剂，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶IC₅₀分别为15.39 ± 0.30和7.71 ± 0.19 μg/mL；OMAE相应IC₅₀为30.94 ± 0.54和13.32 ± 0.19 μg/mL，对α-淀粉酶活性约为阿卡波糖的一半，对α-葡萄糖苷酶低约1.7倍；UMAE则弱得多（IC₅₀约140.6和67.6 μg/mL）。研究人员避免使用"抗糖尿病功效"一词，因体外消化酶抑制反映生化活性而非生理血糖稳态调节，需考虑胃肠道稳定性、肠道吸收、生物利用度、代谢及系统药效学等因素。（7）基于IC₅₀的生物活性比较：OMAE的ABTS和DPPH IC₅₀分别为15.58 ± 0.33和11.88 ± 0.28 μg/mL，属"很强"抗氧化剂（IC₅₀ < 50 μg/mL）；蛋白质变性抑制和红细胞保护IC₅₀分别为38.77 ± 0.93和30.74 ± 0.18 μg/mL，与双氯芬酸（39.45 ± 1.21和28.47 ± 0.68 μg/mL）数值相当，但无统计学显著差异仅表明特定实验条件下响应无差异，不应解读为药理等效或非劣性；UMAE相应IC₅₀为145.69 ± 2.31和144.88 ± 3.01 μg/mL，约为OMAE的3.8–4.7倍。研究人员基于文献与实验提出IC₅₀活性强度分类框架：抗氧化IC₅₀ < 50 μg/mL为"很强"、50–100为"强"、101–150为"中等"、>150为"弱"；抗炎体外模型IC₅₀与标准药物相当或不超过1.5倍为"强"、2–4倍为"中等"、>4倍为"弱"；α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制IC₅₀与阿卡波糖差异<2倍为"强"、2–5倍为"中等"、>5倍为"弱"。研究局限性包括：仅限体外实验，需动物模型验证生理相关性；单四极杆MS限制化合物鉴定，7个主要峰未表征，暂定木犀草素衍生物与生物活性的关联应视为初步；多酚生物利用度普遍较低可能减弱体内功效，未来需体内药理学评价、MS/MS或NMR高级化学表征及纳米包封等制剂策略提高生物利用度。

讨论与结论：本研究证明超声辅助提取可成功优化以提高Mansoa alliacea花提取物中多酚浓度与富集，在60%乙醇、79 °C、15 min、料液比1:10（w/v）条件下总多酚含量达275.37 ± 1.55 mg GAE/g提取物；需强调响应变量靶向干提取物基质内多酚富集而非从原料花生物质回收的多酚累积质量，故需进一步评价粗提率、总多酚回收率及工艺经济性以评估优化工艺的可扩展性与实际可行性。定性UHPLC-MS分析揭示9个主要色谱峰，其中2个基于UV光谱和单四极杆质谱特征初步鉴定为木犀草素-7-O-葡萄糖苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷，两者在优化提取物中相对丰度均增加。优化提取物较未优化基线提取物表现出显著的体外自由基清除活性、热诱导蛋白质变性抑制、红细胞膜裂解抑制及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制。然而，这些生物学发现代表体外筛选活性，不应解读为体内抗炎或抗糖尿病治疗功效的证据；且9个主要色谱峰中7个未表征、未进行生物活性导向分离，暂定木犀草素结合物与观察到的生物活性之间任何关联仍为相关性而非因果性证明，观察到的活性可能反映多酚提取物基质中多种成分的联合效应和潜在相互作用。总体而言，上述发现为富含多酚的Mansoa alliacea花提取物的潜在功能价值提供了初步化学和生化证据；未来需采用高分辨串联质谱（HRMS/MS）、生物活性导向分级、药代动力学评价及适当体内模型，以鉴定贡献活性的成分并进一步确立其生物学和转化相关性。