《Microbiology Research》：Culture-Based Identification and Antimicrobial Susceptibility of Bacterial Isolates Recovered from Rabbits with Clinical Signs Compatible with Epizootic Rabbit Enteropathy in Hidalgo, Mexico
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家兔流行性肠病（Epizootic Rabbit Enteropathy, ERE）是影响断奶后家兔的一种胃肠道疾病。本研究旨在描述从墨西哥伊达尔戈州31只具有与ERE相符临床症状的家兔盲肠内容物中回收的可培养细菌分离株。研究人员采用基质辅助激光解吸/电离飞行
家兔流行性肠病（Epizootic Rabbit Enteropathy, ERE）是影响断奶后家兔的一种胃肠道疾病。本研究旨在描述从墨西哥伊达尔戈州31只具有与ERE相符临床症状的家兔盲肠内容物中回收的可培养细菌分离株。研究人员采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）对培养分离株进行鉴定，并对部分分离株测定所选抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。共回收126株细菌分离株。最常鉴定的分离株为大肠杆菌（Escherichia coli，80.16%）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis，5.56%）和摩根摩根菌（Morganella morganii，4.76%）；这些百分比反映的是回收培养分离株的比例，而非受影响家兔的比例。鉴定记录不完整及评分低于种水平阈值限制了对部分分类学归属的确认。各受试分离株的MIC存在差异，结果仅作描述性解读；不同抗菌药物间MIC值的差异不被视为比较临床疗效的证据。这些依赖培养的发现描述了所采样的分离株集合，不代表完整盲肠微生物群的组成或多样性。由于缺乏对照组，这些结果不能确立细菌富集、疾病特异性或与ERE的关联，但提示了一种识别该病潜在致病因子的初步方法。
研究背景：家兔养殖在小规模生产系统中对食物供给和家庭收入具有贡献，养殖管理和生物安全是动物健康的重要支撑。家兔流行性肠病（Epizootic Rabbit Enteropathy, ERE）是断奶后和育肥期的重要胃肠道疾病，其临床和病理表现包括采食量下降、腹部胀气、胃肠道扩张、盲肠停滞和黏液蓄积，但肠道症状并非ERE特异性，临床相符性应与病因学确诊相区分。ERE的病因尚未完全阐明，实验性传播研究虽能重现该综合征的临床和病理特征，但并不能证明从患病家兔中回收的每一种细菌均参与致病。盲肠微生物群落研究报告了患病与未患病家兔之间的差异，这些观察支持对微生物参与的探究，但不应被解释为单个检出分类群即为致病因子的证据。此外，先前的初步调查描述了从家兔盲肠内容物中培养细菌的表型和显微镜特征，对现有本地分离株集合的进一步表征可提供有关分类学鉴定记录、所选毒力相关基因和抗菌药物最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）的描述性信息。抗菌药物耐药背景具有重要意义，因为已有研究者报道了家兔中的多重耐药大肠杆菌（Escherichia coli）谱系。然而，来自所选分离株的描述性MIC结果不能确立耐药谱系的流行率、人畜共患传播或比较临床疗效。
研究开展与结论：本研究旨在描述从墨西哥伊达尔戈州具有与ERE相符临床症状的家兔盲肠内容物中培养的细菌分离株。研究人员采用MALDI-TOF MS进行类群表征，对所选分离株进行cnf1、cnf2和hlyA的PCR筛查，并测定MIC以描述所选亚组对受试抗菌药物的体外反应。研究共从31只具有ERE相符临床症状（包括腹泻、厌食、腹部胀气和粪便中透明黏液）的家兔盲肠样本中鉴定出126株细菌分离株。最频繁的细菌为大肠杆菌（80.16%），其次为粪肠球菌（Enterococcus faecalis，5.56%）、摩根摩根菌（Morganella morganii，4.76%）等。对101株分离株的PCR分析显示，无分离株对cnf1或hlyA呈阳性，而8株（8/101；7.9%）对cnf2呈阳性。抗菌药物敏感性试验显示所选细菌分离株间MIC值存在异质性，恩诺沙星（enrofloxacin）通常比其他受试抗菌药物产生更低的MIC值，而β-内酰胺类MIC值在分离株间存在差异。由于并非所有细菌种类-抗菌药物组合均有适用的标准化临床折点，MIC值以描述性方式呈现，未归入敏感或耐药类别。研究的重要意义在于：这些依赖培养的发现描述了所采样的分离株集合，提示了一种识别该病潜在致病因子的初步方法，并支持将ERE解释为一种复杂的、可能多因素的疾病，而非可归因于单一细菌因子的疾病。
关键技术方法：本研究为描述性、依赖培养的研究，纳入墨西哥伊达尔戈州Tulancingo地区11个商业家兔养殖场的31只自然发病家兔（依据生产者的通知和临床患病动物的可获得性进行非概率采样，未进行先验样本量计算）。采集盲肠内容物后进行需氧培养分离，采用MALDI-TOF MS进行细菌鉴定（评分≥2.0视为种水平可靠鉴定，1.700至<2.000视为属水平鉴定）；对所选分离株进行cnf1、cnf2和hlyA毒力相关基因的PCR筛查；采用Etest?条带法对所选分离株亚组测定氨苄西林（ampicillin, AMP）、阿莫西林（amoxicillin, AMX）、恩诺沙星（ENR）和万古霉素（vancomycin, VAN）的MIC。
研究结果：（1）细菌鉴定：从31份盲肠样本中鉴定出126株细菌分离株，大肠杆菌最为频繁（80.16%），其次为粪肠球菌（5.56%）、摩根摩根菌（4.76%）、不动杆菌属（Acinetobacter sp.，2.38%）和赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.，1.59%），其余多种细菌各占0.79%。上述百分比为培养分离株的比例，不代表受影响家兔的比例，亦不代表在盲肠微生物群中的相对丰度。（2）毒力相关基因PCR筛查：对101株分离株的PCR分析显示，无分离株对cnf1或hlyA呈阳性，8株（7.9%）对cnf2呈阳性；阳性对照扩增产物大小符合预期（cnf1和cnf2为543 bp，hlyA为569 bp），无模板对照无扩增。该检测针对目标基因，而非确认菌种身份或确立致病性。（3）抗菌药物敏感性：所选细菌分离株间MIC值存在异质性，恩诺沙星通常显示较低的MIC值，β-内酰胺类MIC值在分离株间存在差异；由于缺乏适用于所有细菌种类-抗菌药物组合的标准化临床折点，且药敏试验仅对所选分离株而非整个分离株群体系统开展，结果以描述性方式解读，不支持cnf2携带与抗菌药物耐药或敏感性降低之间的关联。对大肠杆菌分离株的个体MIC值亦以描述性方式呈现。
讨论部分总结：先前研究已探究细菌与ERE的关联，并描述了从患病家兔中回收的微生物或肠道微生物群落的变化，本课题组在Tulancingo Valley家兔养殖场的初步观察也记录了与肠道革兰阴性菌表型特征相符的细菌回收，但这些观察仅提供背景，不能确立所检分离株的病因学作用。在本分离株集合中，大肠杆菌在所用培养条件下为最频繁的记录鉴定，但不动杆菌属、赖氨酸芽孢杆菌属等的出现并不指示细菌富集、疾病特异性或对ERE的贡献；研究人员未评估毒素产生（包括河豚毒素产生），因此不能推断毒素介导的临床体征贡献。Solans等采用细菌培养和靶向分子检测研究了商业家兔养殖场的临床肠病，检测到多种肠道病原体及生长家兔中频繁的混合感染，其发现强调在解读肠道临床体征时需考虑替代性和并发性感染。本研究中抗菌药物敏感性试验显示所选分离株对氨苄西林、阿莫西林、恩诺沙星和万古霉素的MIC值存在异质性；大肠杆菌作为优势培养分离株的检出应在兔生产抗菌药物耐药背景下考量，Silva等记录了家兔中的多重耐药大肠杆菌谱系，而本研究评估的是有限、非系统选择的分离株群体且未进行基因组表征，因此不能确立多重耐药克隆的流行率或其人畜共患潜力。研究指出粪肠球菌并非严格致病，某些菌株可产生乳酸和细菌素并已被研究用于兽医益生菌应用；类似兽医细菌学研究强调MIC结果必须依据细菌种类、受试抗菌药物和有效临床折点的可及性进行解读。此外，不评估抗菌药物耐药和毒力决定因素就不能假定其安全性，使用抗生素治疗ERE可改变微生物多样性并影响有益菌，因为已知断奶家兔健康的一个决定因素是肠道微生物多样性；杆菌肽和泰妙菌素等抗生素已被用于治疗ERE，但可能诱导肠道微生物群失衡进而导致菌群失调。尽管已鉴定出ERE发展过程中存在的多种细菌，但仍缺乏明确诊断以指导有效治疗，因为所呈现的体征可能与其他病毒或寄生虫疾病混淆；已发现轮状病毒与其他病原体协同作用可改变肠道微生物多样性，使病原体占据共生菌位点进而引起肠病，因此控制该病的治疗必须适当，但过度使用可能引发病理过程，且实验性使用抗生素治疗ERE并不减轻致病性并可能引起肠病。研究认为，本发现支持将ERE解释为一种复杂的、可能多因素的疾病，而非可归因于单一细菌因子的疾病；大肠杆菌在所用培养条件下为最频繁回收的细菌种类，但由于细菌学分析完全基于依赖培养的方法，该发现不能解释为大肠杆菌在完整肠道微生物群中过度代表的证据，回收的分离株仅代表在所采用实验条件下检测到的可培养细菌部分，因此需要包括高通量16S rRNA基因测序或宏基因组分析在内的非依赖培养方法来确定ERE是否与肠道微生物群落组成、多样性或结构的改变相关。本研究存在若干局限性：观察性和描述性设计无法确立回收细菌分离株与ERE发展之间的因果关系；基于需氧培养且无选择性或厌氧条件的依赖培养方法仅代表盲肠微生物群落的一部分，无法就整体微生物群组成或菌群失调得出结论；抗菌药物敏感性试验仅在有限且非系统选择的分离株亚组中进行，无法进行稳健的群体水平抗菌药物敏感性估计或评估cnf2携带与抗菌药物耐药之间的关联；动物数量相对有限及纳入家庭生产系统的自然发病病例可能限制发现的普适性。未来研究应整合系统性抗菌药物敏感性试验和非依赖培养的微生物组方法，以阐明与ERE相关的复杂微生物和病理特征。
研究结论翻译：本研究描述了在所用培养条件下从具有与ERE相符临床症状的家兔中回收的可培养细菌部分，并附有选定的PCR和MIC结果。研究发现适用于所采样的分离株，不能确立在ERE中的病因学作用，也不支持治疗建议。MIC观察为描述性的，不提供抗菌药物耐药的群体水平估计。未来研究应结合厌氧培养和非依赖培养方法，纳入适当的对照组，并将动物水平和分离株水平的记录相关联。
