《Microbiology Research》：Morphological and Molecular Characterization of an Incertae Sedis Agaricoid Fungus Associated with Date Palm (Phoenix dactylifera L.)
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海枣（Phoenix dactylifera L.）是苏丹具有重要经济价值的作物，其衰退症状可能与多样且认识不足的真菌群落有关。研究人员从苏丹喀土穆州一果园内有症状海枣上或其附近出现的担子果中，持续分离到一种未分类的伞菌状真菌。受害植株表现褪绿、生长减缓、叶片
海枣（Phoenix dactylifera L.）是苏丹具有重要经济价值的作物，其衰退症状可能与多样且认识不足的真菌群落有关。研究人员从苏丹喀土穆州一果园内有症状海枣上或其附近出现的担子果中，持续分离到一种未分类的伞菌状真菌。受害植株表现褪绿、生长减缓、叶片下垂、渐进性褐变及干枯。基于形态特征和ITS1-5.8S-ITS2序列对6个分离株（A–F）进行了检验。与Ganoderma典型的孔状担子果不同，这些分离株产生具菌褶和菌柄的蘑菇状担子果。若干形态特征亦与Hohenbuehelia的典型描述不同，尤其是中央着生的菌柄及离生或窄附生菌褶。BLASTn分析（v. 2.17.0）显示与现有Hohenbuehelia序列的ITS序列同一性仅为83–89%。在当前ITS数据集中，分离株A–F形成支持度强的单系群（自举值99–100%），位于所采样的Hohenbuehelia和Ganoderma序列之外。这些结果有助于阐明分离株在当前数据集所包含分类单元中的系统发育位置，但不足以进行正式的属级分类或确认新分类单元。此外，经过12个月的人工接种，未观察到一致的病害症状，海枣衰退的致病因子无法确定。本研究报道了一种与衰退海枣相关的未鉴定伞菌状真菌，并强调在确立其分类身份和生态学意义之前，需要对伞菌目（Agaricales）进行更广泛的采样、多位点系统发育分析、详细的形态学表征以及严格控制的致病性试验。
研究背景方面，海枣（Phoenix dactylifera L.）是非洲尤其是苏丹北部最古老且最重要的果树作物之一，受多种病害和衰退综合征影响。由Ganoderma spp.引起的基茎腐病是多个产区棕榈的重要病害，2009年首次在苏丹Elbawga灌区发现。本研究调查的果园中，受害棕榈表现明显黄化和退化，伴有生长迟缓、叶片下垂、渐进性褐变和干枯。然而仅凭症状学不足以确定病因，因为相似的衰退症状可能由不同生物或非生物因素引起。由于在某些有症状棕榈上或其附近观察到不寻常的伞菌状担子果，因此开展了相关真菌的形态学、培养学和分子特征鉴定。担子菌门（Basidiomycota）包含超过40,000种，约占已描述真菌的三分之一。伞菌目（Agaricales）是担子菌门中多样性最丰富的目之一，其分类基于系统发育关系和亚目的独特形态特征。Hohenbuehelia spp.主要特征为匙形肾状或扇形菌盖，通常在菌盖表面下有胶质层，延生菌褶，菌柄退化或缺失，椭圆形担孢子和粗壮囊状体。基于25S rDNA的系统发育研究表明Hohenbuehelia与Pleurotus不同，确认其为侧耳科（Pleurotaceae）中的单系群。本研究旨在鉴定与苏丹喀土穆州海枣衰退相关的未分类伞菌状真菌，评估所获材料的宏观和微观特征并与选定的形态学相关参考分类单元进行比较，利用系统发育分析评估ITS1–5.8S–ITS2序列亲缘关系。ITS在许多担子菌门中不足以进行属级的正式分类界定，分子分析仅作为初步框架以评估分离株是否嵌套在所采样参考分类单元内，而非建立新属或种。研究还检验了人工接种是否能重现田间观察到的衰退症状。
研究人员开展了以下研究：对喀土穆州一果园（纬度15.5974°，经度32.5356°）衰退海枣种群进行调查，2022年9月至12月多次实地考察中对约1.5 feddan果园中90株海枣进行全面调查，30–35%的棕榈显示衰退症状。从有症状棕榈上或其附近采集成熟担子果用于真菌分离，最终保留6个纯培养物（分离株A–F），来自果园不同位置不同树龄的不同棕榈树，为独立田间采集而非单一担子果的技术性继代培养。研究人员得出以下结论：分离株产生具菌褶和中央菌柄的伞菌状担子果，与Ganoderma的孔状担子果不同；若干形态特征亦与Hohenbuehelia典型描述不同，尤其是中央着生菌柄和离生或窄附生菌褶；BLASTn分析显示与现有Hohenbuehelia序列ITS同一性仅83–89%；在当前ITS数据集中分离株A–F形成支持度强的单系群（自举值99–100%），位于所采样的Hohenbuehelia和Ganoderma序列之外；但有限的分类单元采样、缺乏多位点框架及单基因座ITS数据集不支持确认新属或任何正式分类单元；12个月人工接种未产生一致的病害症状，且真菌是从相关担子果而非受害棕榈内部组织分离的，海枣衰退的病因未能确定。重要意义在于本研究报道了一种与衰退海枣相关的未鉴定伞菌状真菌，强调在确立其分类身份和生态学意义之前需要更广泛的伞菌目采样、多位点系统发育分析、详细形态学表征和严格控制的致病性试验。
主要关键技术方法方面（不超过250字）：研究对果园90株海枣进行田间症状调查并采集担子果；采用组织分离法从担子果片段获得纯培养物（分离株A–F，来自不同棕榈树的独立田间采集）；进行宏观和微观形态学观察与测量（每种结构25次测量）；采用CTAB法提取基因组DNA，用通用真菌引物ITS1和ITS4扩增ITS1–5.8S–ITS2区域并进行双向Sanger测序，序列提交NCBI GenBank（登录号PV985354–PV985359）；采用BLASTn进行序列相似性搜索，用MUSCLE在MEGA12中进行比对，以GTR+I+G模型构建最大似然树（1000次自举迭代），以Pleurotus cystidiosus var. formosensis（MH862689）为外群；进行人工接种试验（棕榈树干消毒、创伤、插入定殖PDA琼脂块，12个月监测）；对菌落半径进行单因素方差分析（ANOVA）及Fisher's LSD检验。样本队列来源为苏丹喀土穆州一私人果园。
研究结果方面：3.1 症状学——在苏丹中部喀土穆州一私人果园观察到衰退海枣树，症状为褪绿、普遍衰退、矮化、叶片向下弯曲，随后褐变和干枯，部分棕榈仅一侧显示症状后发展至其他叶片。雨季结束时在树干周围及邻近土壤表面注意到白色棉絮状菌丝生长，随时间增长在部分衰退棕榈周围土壤中及某些情况下树干基部出现污白色至米色、后变为褐色的担子果。田间症状最初被认为类似Ganoderma spp.相关衰退综合征，但采集的担子果为伞菌状具菌褶而非孔状，因此形态学和分子分析需要与Hohenbuehelia及其他伞菌状分类单元进行比较。当前证据表明该真菌并非归于Hohenbuehelia或Ganoderma，而是一种未分类的伞菌状伴生真菌。3.2 宏观形态特征——担子果为地上生具菌褶真菌，菌盖凸面至近球形，后期通常钟形或穹顶形，菌盖直径1.5–3.0 cm，半球形至钟形，随成熟略微扩展。菌盖表面干燥、细纤维状至略被绒毛，淡白色至浅米色，向盘区略深，部分菌盖淡褐色。边缘初凹后直或略抬高，部分标本沿下方菌褶方向具细条纹。成熟菌盖干燥、褐色具同心环带。菌褶松散附着，与菌柄几乎成直角附着并占据菌柄表面较大面积，均匀间隔且对称，自菌柄辐射，边缘光滑无锯齿或分枝，深褐色至暗褐色，略腹鼓。短菌褶（lamellulae）插入长菌褶之间。菌柄纤细、中央着生，直径约2–3 mm，长约3–5 cm，纤维质、纤细，基部略窄，部分略弯曲，表面光滑至细条纹，顶端淡褐色至灰白色，向基部变深。3.3 培养特征——所有分离株在PDA上产生白色蓬松气生菌丝，伴红褐色色素沉着于菌落表面及背面。三周培养后菌落半径在分离株间差异显著（单因素ANOVA：F(5,18)=12.786，p=0.000021）。分离株B（3.40±0.29 cm）和F（3.33±0.43 cm）菌落半径最大且彼此无统计学差异，二者显著大于分离株A（2.23±0.38 cm）、C（2.05±0.42 cm）、D（2.15±0.42 cm）和E（1.90±0.28 cm），后四者之间无显著差异（Fisher's LSD检验，α=0.05）。3.4 微观形态特征——担孢子光滑、厚壁、具清晰内壁结构，椭圆形至卵形，有时近球形，非淀粉质和非糊精质，所用显微镜下未见明显油滴。透明、具隔膜、光滑壁菌丝宽约3–6 μm， examined specimens中未见锁状联合。还观察到球形厚壁结构，但其是否为厚垣孢子需进一步发育或形态特征确认。3.5 分子鉴定与系统发育分析——分离株A–F的ITS1–5.8S–ITS2序列提交NCBI GenBank（登录号PV985354–PV985359）。BLASTn（v. 2.17.0）分析显示与现有Hohenbuehelia参考序列同一性83–89%。分离株A–F间内部分支模式显示采集标本内ITS变异性，但分支长度不能说明培养物是一个还是多个种。通过将ITS1–5.8S–ITS2序列与GenBank中选定的Hohenbuehelia和Ganoderma参考序列比较，在MEGA12中构建探索性最大似然树，外群为Pleurotus cystidiosus var. formosensis（MH862689），节点支持用1000次自举重复评估。分离株B和F反复形成支持度强的姐妹对，A和E也聚在一起，C和D依次置于A–F簇内。A–F组合与当前ITS数据集中所采样参考属不同。在当前ITS数据集中，分离株A–F始终形成支持度强的单系群（自举值99–100%），未聚类于所采样的Hohenbuehelia或Ganoderma序列内。在联合分析中，A–F分支与两个所采样属明显不同，拓扑结构更类似于所采样Hohenbuehelia群而非Ganoderma，但这仅记录于当前分类单元采样，不表明分离株属于Hohenbuehelia，也不确认新属。3.6 人工接种——12个月人工接种试验中，接种部位未观察到一致或诊断性病害症状，分析无法确认所分离真菌是田间观察到的衰退症状的原因。目前与病害关联的唯一证据是该真菌最初从与棕榈衰退相关的担子果组织而非直接从棕榈病内部组织分离。
讨论部分总结：所采集真菌目前不能可靠鉴定为Hohenbuehelia或Ganoderma。其担子果为伞菌状具菌褶和中央菌柄，不同于许多Hohenbuehelia种的侧生菌柄或无柄及延生菌褶的侧耳状结构；与Ganoderma基本不同在于具菌褶而非孔状子实层。两属均表现食线虫行为，通过菌丝上产生粘性球（捕食模式）或通过菌丝齿上产生的无性分生孢子或来自子实体的担孢子萌发（寄生模式）捕获线虫。这些结果需在伞菌目更广泛背景下与侧耳科及其他形态相似的伞菌状分类单元比较。海枣上观察到的症状与Ganoderma zonatum作为致病因子的初步诊断一致。此外，担孢子形态与Ganoderma种特征相似，尤其是厚双层或多层壁及内部结构。孢子壁某些特征表面上类似于Ganoderma，但这种相似性不应掩盖担子果的显著差异。Ganoderma种为多孔菌具孔状子实层，可产生有盖、无柄、侧生具柄或某些分类单元具柄担子果，因此该属不能基于缺乏明显菌盖和菌柄来定义。反之，中央形成的菌柄和窄附生菌褶不是Hohenbuehelia典型的侧耳状结构。综合特征集使标本可作为未分类伞菌状真菌研究，待进一步广泛形态学和分子分析。ITS分析表明分离株A–F形成支持度强的单系群（自举支持99–100%），与所采样Ganoderma和Hohenbuehelia序列不同。联合系统发育树中A–F分支位置更接近所采样Hohenbuehelia分支而非Ganoderma，同时与所含Hohenbuehelia序列保持不同。然而该拓扑结构不应解释为属级放置的证据，因为分析基于单基因座和有限分类单元采样。三个探索性树保留以说明A–F分组在不同参考集下的行为，联合树代表主要比较分析。A–F分支内部分支模式表明采集标本间ITS序列变异，但仅分支长度不能确定这些分离株代表一个种还是多个种。BLASTn搜索显示A–F分离株与检索到的Hohenbuehelia参考序列间约83–89%序列同一性，这些值表明与所采样数据库参考序列有显著序列分化，但本身不确立分类等级或新颖性。ITS序列相似性须谨慎解释，因为真菌谱系间ITS属内和属间变异程度差异很大，没有通用ITS同一性阈值能可靠界定真菌属。Hohenbuehelia是形态学和生态学多样的属。此外BLAST相似性可受参考数据库中分类单元代表性、序列质量、查询覆盖度、数据库注释和比对特征影响。因此BLAST结果被视为与所采样Hohenbuehelia参考序列分化的初步证据而非分类新颖性的确定证据。分离株A–F的可靠分类评估需要整合详细形态学和微观特征与更广泛分类单元采样及多位点系统发育分析。改进伞菌目内采样，包括相关模式或模式衍生标本序列（如可获得），以及LSU、tef1-α和rpb2等额外基因座，在提出任何正式分类之前是必要的。菌落半径在分离株间显著不同，B和F在测试条件下显示比A、C、D和E更大的平均菌落半径。某些生长簇类似于ITS拓扑特征，但菌落生长表型与ITS亚分支的正式相关性未研究，因此生长数据不应视为系统发育亚群共同遗传或生理特征的证据。人工接种实验在12个月期间未诱导一致的病害症状。这一不利结果以及移除担子果而非在棕榈受害内部组织中鉴定真菌，表明目前不能建立海枣衰退中因果关系的存在。该真菌可能是腐生菌、次生定殖者或受胁迫棕榈的其他伴生菌；其致病性是一个需要证明的假设，需要适当重复对照、环境条件记录、再分离、分子确认及可能更长期的实验。仅症状不足以确定病因，因为不同真菌可能参与相似衰退综合征，受胁迫植物组织中可能存在隐存或机会性分类单元。准确鉴定参与植物退化真菌需要整合形态特征、基于序列的信息、适当分类单元采样，以及当暗示因果关系时严格控制的致病性试验。因此本工作应视为与衰退海枣相关的未分类伞菌状真菌的初步描述，而非新分类单元或病原体的证据。
研究结论部分翻译：本研究报道了苏丹中部与海枣（Phoenix dactylifera L.）衰退相关的一种未分类伞菌状真菌。分离株在初步鉴定阶段与所评估分类单元显示某些形态相似性，但中央形成的菌柄、离生至窄附生菌褶及其他所述特征不支持将其明确归入Hohenbuehelia。ITS分析一致地将分离株A–F置于与所采样Hohenbuehelia和Ganoderma序列分开的支持度强的分支中。然而有限的分类单元采样、缺乏多位点框架以及单基因座ITS数据集不支持确认新属或任何正式分类单元。与现有Hohenbuehelia参考序列83–89%的ITS同一性也表明与所采样序列的分化，但不作为属界定的标准。12个月人工接种未导致一致的病害症状，且真菌是从相关担子果而非受害棕榈内部组织分离的。棕榈衰退的原因未能确定。这些分离株的分类位置和生态作用需要通过更广泛的伞菌目采样、纳入模式或模式衍生参考序列（如可获得）、涉及LSU、tef1-α和rpb2的多位点分析、改进的形态学记录以及严格控制的接种和再分离实验来解决。
