椴树蜜中多种成分的植物与动物来源溯源：从叶片、花朵、花蜜、蜜露到蜂蜜

《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》：From leaves, flowers, nectar, honeydew to linden honey: tracing the origin of numerous constituents

　　

蜂蜜具有复杂组成，来源于花蜜和/或由植食性昆虫分泌的蜜露。这一特征同样适用于椴树蜜（Tilia spp.），其组成反映了多种植物与动物来源，但若干化合物的来源仍不明确。本研究旨在鉴定椴树蜜中特定化合物的来源。研究人员分析了电导率不同的两组蜂蜜样品以及椴树叶片、花朵、花蜜和蜜露中的糖类、氨基酸、无机离子和有机酸，采用基于HPLC（高效液相色谱）的方法。化学轮廓比较使得众多化合物的来源得以归属。样品类型主要在糖类组成上存在差异：花蜜以葡萄糖和果糖为特征，而蜜露和蜂蜜含有蚜虫或蜜蜂产生的各种二糖和寡糖。蜂蜜的氨基酸组成受蜜蜂强烈影响，尤其是脯氨酸和苯丙氨酸。花蜜和蜂蜜中的无机离子含量在很大程度上反映了植物组织组成，而蜜露含有显著更高浓度的无机离子，尤其是磷酸盐。有机酸轮廓也差异显著：葡萄糖酸主要由蜜蜂产生，在蜂蜜中占主导地位，而苹果酸是蜜露的特征性有机酸。PLS-DA（偏最小二乘判别分析）清晰地将叶片、花朵、花蜜、蜜露和蜂蜜区分开来，尽管未能完全区分电导率不同的两组蜂蜜。然而，电导率较高的蜂蜜含有显著更高浓度的若干二糖和寡糖、无机离子以及苹果酸，相较于电导率较低的蜂蜜。

椴树（Tilia spp.）是中南欧多个国家以及世界其他地区（如中国）最重要的蜂蜜植物来源之一。在欧洲西北部，主要分布两种原生椴树：T. cordata Mill.和T. platyphyllos Scop.。蜂蜜由蜜蜂（Apis mellifera）从开花植物的花蜜或植食性昆虫的排泄物（即蜜露）生产。就椴树而言，蜜蜂可利用花蜜和蜜露两种来源生产蜂蜜，通常使用两者的混合物。椴树具有众多芳香的淡黄绿色花朵，花蜜在萼片基部的蜜腺中产生，吸引包括蜜蜂在内的各种昆虫。花蜜是富含糖类的甜味溶液，以葡萄糖、果糖和蔗糖为主，不同植物物种间己糖与蔗糖的比例可变。花蜜中还含有氨基酸、无机离子、挥发性物质和众多其他次生化合物，但浓度一般较低。大多数植物物种的韧皮部汁液以蔗糖为主，但某些物种的韧皮部中还运输棉子糖-寡糖或糖醇。蚜虫和介壳虫等各种昆虫以寄主植物叶片的韧皮部汁液为食，利用其中的氨基酸和其他化合物作为营养，并以蜜露形式排泄多余的糖。蜜露的组成因昆虫种类和寄主植物而异。与韧皮部汁液相比，蜜露含有更多种类的糖；除葡萄糖、果糖和蔗糖外，还存在其他二糖和三糖（如松三糖、水苏糖）。与花蜜和蜜露类似，蜂蜜也主要由糖类组成（75–80%，w/w）。此外，还检测到众多次要成分，如有机酸、无机离子、氨基酸、挥发性化合物或蛋白质。蜂蜜的化学组成取决于其植物、动物和地理来源以及环境条件。葡萄糖和果糖通常是最主要的糖类，但蜂蜜还含有大量二糖、三糖和其他寡糖。蜂蜜中的这些糖类、氨基酸或有机酸主要由蜜蜂通过酶促转化花蜜或蜜露中的糖类和其他化合物而产生。花蜜蜂蜜的化学组成和理化参数与蜜露蜂蜜不同，例如在电导率、糖谱或矿物质含量方面。根据欧洲法规，花蜜蜂蜜的电导率一般须≤ 0.8 mS cm?1，而蜜露蜂蜜须≥ 0.8 mS cm?1。此外，花蜜蜂蜜含有更多单糖和更少的二糖、三糖和寡糖，其矿物质含量也低于蜜露蜂蜜。椴树蜜在理事会指令2001/110/EC中是一个例外，因为在开花期蜜蜂既采集花蜜也采集叶片上的蜜露。根据花蜜或蜜露的比例不同，这可能导致椴树蜜中矿物质含量不同，从而电导率值也不同。因此，该指令未规定椴树蜜的电导率上限，纯椴树蜜的电导率可超过0.8 mS cm?1。蜂蜜的真实性及其植物和动物来源是一个日益重要的课题。蜂蜜花粉分析（蜂蜜孢粉学）是分析蜜蜂访问了哪些植物物种（植物来源）的常用方法。根据蜂蜜中蜜露的比例，可发现各种蜜露元素，如真菌孢子、微藻或蜡管。由于蜜露元素可能不具有物种特异性，这些分析不能用于确定蜜露蜂蜜的植物来源。此外，已有若干关于多种蜂蜜化学组成的化学分析。然而，将植物叶片、韧皮部、花蜜或蜜露的化学成分与相应蜂蜜的化学成分相关联的研究很少。当花蜜和蜜露（或两者的混合物）可来源于同一植物物种时，情况尤其如此。本研究旨在探究椴树蜜中各种化合物的植物和动物来源。因此，研究人员分析了整个生产链——从植物组织（叶片和花朵）经花蜜或蜜露到椴树蜜——中15种糖类（单糖、二糖、三糖和四糖）、22种氨基酸、9种无机离子和5种有机酸的存在和浓度。通过比较分析和多元统计方法，研究了电导率较低和较高的椴树蜜之间的特征差异，并将选定化合物归属于其可能的植物和动物来源。

材料与方法部分，蜂蜜样品通过德国霍恩海姆大学生态农业研究所从选定的养蜂人处获得。所有蜂蜜样品于2023年至2025年间在德国采集，主要来自椴树（Tilia cordata Mill.、T. platyphyllos Scop.及其自然种间杂种T. x europaea L.）。根据欧洲法律，某些花蜜蜂蜜的电导率须≤ 0.8 mS cm?1，某些蜜露蜂蜜须≥ 0.8 mS cm?1。椴树蜜不受该指令限制，因为它可由花蜜和蜜露两者制成。然而，由于电导率可提供花蜜或蜜露比例的指示，研究使用了10个电导率低于0.8 mS cm?1（0.54–0.71 mS cm?1）的蜂蜜样品和10个电导率高于0.8 mS cm?1（0.81–1.26 mS cm?1）的样品。植物来源最初根据蜂箱位置确定。为确认蜂蜜样品的花源，按照von der Ohe等人的方法进行了定性蜂蜜孢粉学分析。至少计数500粒花粉粒及蜜露元素（HDE），并确定蜜露元素与花粉粒的比值（HDE/PG）。由于目前无法区分不同椴树物种的蜂蜜，所有样品均归类为Tilia spp.。所有样品在分析前于约18–20 °C避光干燥条件下储存。蜜露生产者是椴树蚜（Eucallipterus tiliae L.），其身体呈淡黄色至橙色并带有黑色斑点。由于大多数蚜虫栖息于叶片下表面，其排泄的大部分蜜露落在下方叶片的上表面。通过用50 μL超纯水（Millipore）清洗叶片上表面获得来自不同椴树的10个不同蜜露样品。部分来自不同个体的蜜露液滴用微量移液器直接收集，每样品合并至1 μL体积并用50 μL超纯水（Millipore）稀释。所有样品在进一步分析前储存于-80 °C。使用微量移液器从不同椴树的不同花朵采集10个不同花蜜样品。椴树主要在六月开花。花蜜位于萼片基部，通常易于获取。每朵花可采样1至最多4 μL花蜜。不同花朵的花蜜合并至每样品5 μL花蜜体积。花蜜样品用超纯水（Millipore）稀释并储存于-80 °C直至进一步分析。为测试花蜜糖组成的变化，花蜜在采样后立即分析，并在24 h后重新分析。在此期间，样品在室温下储存以允许花蜜中任何代谢过程进行。叶片与蜜露采样平行收集，花朵与花蜜采样平行收集。采集10个叶片和花朵样品，每样品含三片叶或三朵花。注意确保叶片表面无蜜露残留，花朵不含可见花蜜或花蜜已被去除。样品储存于-80 °C直至进一步提取和分析。采用氯仿-甲醇-水提取法从叶片和花朵中提取可溶性代谢物和离子。提取使用200 mg在液氮中冷冻的研磨植物材料。提取获得的水相储存于-80 °C直至进一步分析。蜂蜜（1 g）溶解于40 mL超纯水（Millipore）中，溶液以5,000 rpm离心10 min以分离花粉和其他物质。溶液储存于-80 °C直至分析，分析在蜂蜜采收当年进行。分析时，样品用超纯水（Millipore）稀释。单糖、二糖和寡糖的分析采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAEC-PAD），参照Shaaban等人的方法。糖类分离使用阴离子交换柱（Carbopac? PA10 4 mm x 250 mm；Dionex corp, Sunnyvale, CA, United States），检测使用脉冲安培检测器（ESA Model 5200, Coulochem II, Bedford, MA, USA）。每样品糖类先在80 mM氢氧化钠中等度洗脱，第二次运行用200 mM洗脱以确保所有糖类的最佳分离。糖类校准标准品（葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、松二糖、曲二糖、龙胆二糖、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽酮糖、松三糖、水苏糖、棉子糖、1-蔗果三糖、异麦芽三糖和水苏糖）在0至250 μmol/L浓度范围内平行分析以生成各自校准曲线。蜂蜜样品中的糖浓度通过比较色谱峰面积与校准曲线确定。此外，定期使用标准加入法验证结果以确保准确性和可靠性。由于葡萄糖、果糖和其他糖类含量的显著差异，蜂蜜样品在两个不同稀释度下分析（葡萄糖和果糖1:1000，二糖和寡糖1:50）。游离氨基酸的定量采用高效液相色谱（HPLC）柱前衍生化法，参照G?ttlinger等人的方法。含伯氨基的氨基酸使用邻苯二甲醛（OPA）衍生化，而含仲氨基的氨基酸（如脯氨酸）使用芴甲氧羰酰氯（FMOC）衍生化以实现选择性荧光检测。使用反相柱（LiChroCart 125-4, Superphere 100 RP-18 endcapped；Merck, Darmstadt, Germany）以乙腈梯度在18 mM磷酸钾（pH 7.1）中分离氨基酸。衍生化氨基酸通过荧光检测，激发和发射波长分别为330和405 nm（OPA）或265和305 nm（FMOC）。校准和样品测量平行进行，因此保留时间与标准品比较以确认峰身份。校准标准品（Sigma-Aldrich, Germany）在0–20 μmol/L浓度范围内测量。无机离子（阴离子：Cl?、PO?3?、SO?2?、NO??；阳离子：K?、Na?、Mg2?、Ca2?、NH??）和有机酸（苹果酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、葡萄糖酸）通过离子色谱分离，随后用导检测器（DX 500, Dionex, Idstein, Germany）定量。无机离子和有机酸根据G?ttlinger等人的方法选择不同色谱柱和洗脱缓冲液进行分离。阴离子使用阴离子交换柱（IonPac? AS4, 4 × 200 mm, Dionex Corp, Sunnyvale, CA, USA）以1.8 mM Na?CO?和1.7 mM NaHCO?为洗脱缓冲液分析。阳离子使用阳离子交换柱（IonPac? CS12A, 4 × 200 mm, Dionex Corp, Sunnyvale CA, USA）和15 mM H?SO?洗脱。有机酸分离使用IonPac阴离子交换柱（IonPac? AS11, 4 × 200 mm, Dionex Corp, Sunnyvale, CA, USA），以氢氧化钠梯度（2至70 mM，30 min内）洗脱。无机离子和有机酸标准品（Sigma-Aldrich, Germany）平行测量（无机离子：0–750 μmol/L，有机酸：0–500 μmol/L），为每种物质创建校准曲线以定量其浓度。为评估用于测定糖类、氨基酸和无机离子的HPLC方法的分析灵敏度，按照Shaaban等人的方法确定检测限（LOD）和定量限（LOQ）。每种化合物的校准曲线一式三份（n = 3）制备：糖类在十个不同稀释度（0–500 μmol/L），氨基酸在六个不同稀释度（0–20 μmol/L），无机离子在十个不同稀释度（0–1000 μmol/L）。不同成分的决定系数范围为R2 = 0.99–1.00。校准曲线的回归参数用于确定检测限（LOD：3.3 Sy/x/a）和定量限（LOQ：10 Sy/x/a），其中Sy/x代表残差标准差，a代表斜率。使用所述HPAEC-PAD系统进行糖分析，所得LOD最低为松二糖（0.3 μmol/L），最高为异麦芽糖（3.4 μmol/L），相应LOQ范围为0.8 μmol/L至10.4 μmol/L。其他糖类的值在此两限之内。使用所述HPLC系统进行氨基酸分析，所得LOD最低为精氨酸（0.1 μmol/L），最高为异亮氨酸（0.4 μmol/L），相应LOQ范围为0.1 μmol/L至3.2 μmol/L。其他氨基酸的值在此两限之内。使用所述HPLC系统分析无机离子，所得LOD最低为氯化物（1.6 μmol/L），最高为硫酸盐（3.2 μmol/L），相应LOQ范围为2.4 μmol/L至9.7 μmol/L。其他无机离子的值在此两限之内。不同化合物确定的LOD和LOQ值与使用相同HPLC系统先前发表的数据一致。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）使用R（版本4.5.2, www.r-project.org）中的mixOmics包进行。响应变量定义为样品组（花、叶、花蜜、蜜露和基于电导率的两种蜂蜜），所有分析变量用作预测变量。数据在构建模型前进行自标准化（均值中心化和缩放至单位方差）。分别为糖类、氨基酸、无机离子和有机酸数据集生成单独的PLS-DA模型。此外，计算了包含所有分析变量的联合模型。模型性能使用得分图、载荷图、变量投影重要性（VIP）得分、混淆矩阵和平衡错误率（BER）评估。BER值越低，模型越准确和平衡。最优成分数基于使用质心距离分类方法的最低BER选择。VIP值大于1.0的变量被认为对区分样品组重要。所有图形表示使用ggplot2包生成。为评估观察到的分类性能是否超过随机预期，组标签随机置换999次，并为每次置换拟合新的PLS-DA模型。计算所有置换模型的BER并与原始模型的BER比较。经验p值从置换分布使用置换检验的标准校正获得。由于没有置换模型的BER等于或低于原始模型，所得经验p值为0.001。统计分析：叶片和花朵组织以及花蜜、蜜露和蜂蜜（电导率低于0.8 mS cm?1和高于0.8 mS cm?1）中糖类、氨基酸、无机离子和有机酸的浓度以均值（±标准差）在表中呈现。为评估各组和成分浓度之间的显著差异，进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验（p < 0.05）。统计分析使用R软件（版本4.5.2, www.r-project.org）进行。

结果部分，蜂蜜样品分为两组。编号1–10的电导率值低于0.8 mS cm?1，编号11–20的高于该值。两组样品的平均水分含量相似：16.9 ± 0.7%（低电导率样品）和16.1 ± 0.6%（高电导率样品）。所有蜂蜜样品中均检测到椴树花粉，比例为19%至57%。其余花粉主要来自Brassica napus、菊科、栗属、刺槐属。这意味着，除一个椴树花粉含量略低的蜂蜜外，所有其他蜂蜜均符合德国法律对椴树蜜的要求（> 20%椴树花粉）。在电导率较低的蜂蜜中，HDE/PG比值较低（最高1.1），而在电导率较高的蜂蜜组中较高（多数> 3）。对椴树叶片、花朵、花蜜和蜜露（由Eucallipterus tiliae产生）以及椴树蜂蜜样品进行了糖类、氨基酸、无机离子和有机酸分析。糖含量最高的是蜂蜜（77.9和79.8 g/100 g蜂蜜），其次是蜜露和花蜜，而叶片和花朵的糖含量显著较低（2.2和3.0 g/100 g叶片或花朵）。氨基酸含量在所有样品类型中远低于糖含量。花蜜和蜜露的含量最低，为1.6 mg/100 mL，而蜂蜜、叶片和花朵中的氨基酸含量在70至89 mg/100 g之间。无机离子含量在所有样品中也远低于糖含量，但高于氨基酸含量。含量最高的是蜜露，其次是叶片。电导率高于0.8 mS cm?1的蜂蜜中无机离子含量显著更高——约为低电导率蜂蜜的两倍。花朵和花蜜的无机离子含量最低。有机酸含量与无机离子含量相似。含量最高的是蜜露，其次是蜂蜜、叶片和花朵，最低的是花蜜。除总糖含量外，不同样品类型中各种糖的含量也不同。蔗糖是叶片和花朵中的主导糖，其次是葡萄糖和果糖。叶片中检测到少量水苏糖，花朵中检测到麦芽糖，而棉子糖含量一般很低。椴树叶片和花朵中未检测到其他糖类。在花蜜中，单糖葡萄糖和果糖以及二糖蔗糖各占总糖含量的一半。此外，检测到少量1→6连接的二糖异麦芽糖和龙胆二糖。然而，应注意龙胆二糖峰未能与松二糖峰完全分离。所有蜜露样品中葡萄糖、果糖、蔗糖以及三糖松三糖和水苏糖浓度较高，其中松三糖为主导三糖。二糖海藻糖、异麦芽糖和麦芽糖也出现在大多数蜜露样品中，尽管量较少。葡萄糖和果糖是蜂蜜中的主导糖（每100 g蜂蜜65.7–66.8 g），两种蜂蜜中果糖含量均高于葡萄糖。所有蜂蜜样品中还检测到各种二糖，其中异麦芽糖含量最高，且在电导率高于0.8 mS cm?1的蜂蜜中显著高于低电导率蜂蜜。松三糖和水苏糖是主导三糖，松三糖在两种蜂蜜中均为最丰富的三糖。此外，松三糖含量在电导率高于0.8 mS cm?1的蜂蜜中显著高于低电导率蜂蜜。蜂蜜样品中还检测到其他几种糖，但量较少。所有蛋白质源性氨基酸存在于叶片和花朵中，大多数样品还含有一些非蛋白质源性氨基酸。主要氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸以及酰胺谷氨酰胺和天冬酰胺，花朵中酰胺含量高于叶片。尽管花蜜或蜜露中氨基酸含量极低，但所有蛋白质源性氨基酸均可检测到，蜜露中还发现一些非蛋白质源性氨基酸。主要氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸以及酰胺谷氨酰胺和天冬酰胺。蜂蜜中的氨基酸组成与其他样品类型显著不同。脯氨酸是蜂蜜中的主导氨基酸，含量为46.0–50.3 mg/100 g，而所有其他氨基酸水平较低。所有样品类型中的主导无机离子是钾（K?）。在叶片、花朵、蜜露和蜂蜜中，磷酸盐（PO?3?）和氯化物（Cl?）是最常见的阴离子，而在花蜜中是Cl?和硫酸盐（SO?2?）。两种蜂蜜之间在K?、钠（Na?）、镁（Mg2?）、钙（Ca2?）、PO?3?和SO?2?含量方面存在显著差异。电导率高于0.8 mS cm?1的蜂蜜中含量高于低电导率蜂蜜。这反映了显著更高的无机离子总含量。苹果酸是植物叶片和花朵中的主要有机酸，其次是柠檬酸和葡萄糖酸。总体而言，蜜露中苹果酸含量最高，而葡萄糖酸是椴树花蜜中的主导有机酸。在蜂蜜中，主导有机酸也是葡萄糖酸，其次是苹果酸和柠檬酸。关于苹果酸含量，两种蜂蜜之间存在显著差异。电导率高于0.8 mS cm?1的蜂蜜中含量约为低电导率蜂蜜的三倍。所有样品类型的糖总和与氨基酸总和、糖总和与无机离子总和以及糖总和与有机酸总和的比值均不同。比值由叶片、花朵、花蜜、蜜露和蜂蜜中糖类、氨基酸、无机离子和有机酸的总浓度计算得出。糖与氨基酸比值 accordingly 在蜜露中最高（约30,000），其次是花蜜（约16,000）、蜂蜜（约1,000），叶片（40）和花朵（34）最低。这意味着花蜜和蜜露相对于氨基酸含有比植物组织多得多的糖。在两种蜂蜜中，总糖与总氨基酸的比值（约1,000）位于这些极端值之间。糖总和与无机离子总和的比值一般低于糖总和与氨基酸总和的比值。然而，该比值在不同样品类型间变化。糖与无机离子比值在电导率低于0.8 mS cm?1的蜂蜜中最高，其次是电导率高于0.8 mS cm?1的蜂蜜、花蜜、蜜露、花朵，叶片最低。关于糖与无机离子比值，两种蜂蜜之间存在显著差异。对于电导率高于0.8 mS cm?1的蜂蜜，该比值是低电导率蜂蜜的一半。总糖与总有机酸的比值类似于总糖与总无机离子的比值。然而，该比值在不同样品类型间也有变化。糖与有机酸比值最高的是花蜜，其次是蜂蜜和蜜露，而叶片和花朵中显著较低。进行PLS-DA得分图以研究椴树来源材料组（叶、花、花蜜、蜜露和电导率< 0.8 mS cm?1及> 0.8 mS cm?1的蜂蜜）之间糖类、氨基酸、无机离子和有机酸的浓度是否存在差异。对每个成分组进行单独的PLS-DA分析，并生成包含所有分析变量的联合模型。糖的PLS-DA解释了总方差的73.6%（PLS成分1：51.6%，PLS成分2：22.0%）。叶片、花朵、花蜜和两个蜂蜜组形成紧密、独特的聚类。两个蜂蜜组沿PLS成分1与其他样品组分离，主要由蔗糖的负载荷以及果糖和麦芽酮糖的正载荷驱动。混淆矩阵表明完美分类，最优三成分模型在三折交叉验证后达到BER为0.074。置换检验表明原始PLS-DA模型（BER = 0.074）显著优于使用随机置换类别标签生成的模型。由于没有置换模型达到相等或更低的BER，经验置换p值为0.001，确认了模型的统计显著性。VIP分析确定了十个最有影响贡献于组区分的糖。最高VIP值见于果糖、麦芽酮糖、异麦芽三糖和异麦芽糖。这表明这些糖对区分样品组贡献最强。对于氨基酸，PLS成分1和成分2分别解释总方差的28.5%和20.0%。得分图显示两个蜂蜜组的清晰聚类。蜂蜜样品与其他组的分离主要与脯氨酸、β-丙氨酸、丝氨酸和天冬氨酸的载荷相关。此处混淆矩阵也显示完美分类，最优五成分PLS-DA模型达到BER为0.107。PLS-DA模型的统计显著性通过置换检验验证（p = 0.001）。VIP分析确定脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸为贡献于样品区分的最重要变量（VIP > 1）。相比之下，无机离子的PLS-DA得分图未显示样品组的清晰分组，尽管PLS成分1和成分2共同解释总方差的60.7%。尽管载荷图显示了贡献变量，但这些未导致清晰、独特的分离。混淆矩阵揭示了样品组之间的若干误分类。然而，置换检验确认三成分模型的分类性能超过随机预期（p = 0.001），模型BER为0.282。VIP图揭示硫酸盐、氯化物、镁、钾和钙为最高变量。有机酸的PLS-DA得分图揭示了独特的聚类模式，叶片和花朵紧密聚类，花蜜和两种蜂蜜类型也如此，而蜜露形成单独聚类。该分析解释总方差的96.1%（PLS成分1：80.9%，PLS成分2：15.2%）。葡萄糖酸和苹果酸贡献于样品组的分离。混淆矩阵揭示了样品组之间的一些误分类。三成分模型达到BER为0.260，置换检验确认观察到的分类性能显著优于随机预期（p = 0.001）。葡萄糖酸和苹果酸 exhibit 最高VIP值，而所有其他变量的VIP得分低于1.0阈值。将所有分析变量纳入PLS-DA模型，得分图清晰地将两个蜂蜜组与其他样品组分离。相比之下，花和叶组显示一些重叠。相应载荷图与先前描述的单独模型一致，并总结了糖类、氨基酸、无机离子和有机酸观察到的载荷模式。混淆矩阵仅显示蜂蜜组的微小偏差和其余样品组的准确分类。置换检验确认PLS-DA模型的统计显著性（p = 0.001），最优五成分模型达到BER为0.079，这是最佳PLS-DA模型。在按VIP得分排名前10的变量中，果糖、脯氨酸和葡萄糖显示最高VIP值（> 1.55），表明它们对组区分的重要性。

讨论部分，椴树叶片提取物含有葡萄糖、果糖、蔗糖和少量棉子糖和水苏糖。这两种寡糖与蔗糖一起是韧皮部中的运输糖，因为椴树叶片的韧皮部汁液含有高浓度蔗糖（20–27 g/100 mL）和较低浓度的棉子糖和水苏糖（8–9 g/100 mL）。相比之下，葡萄糖和果糖在韧皮部中未检测到或仅以低毫摩尔浓度存在。以椴树为食的E. tiliae蜜露中的糖组成与叶片或韧皮部的糖组成差异很大。在糖的PLS-DA中，蜜露聚类与叶、花、花蜜聚类以及蜂蜜聚类之间也可见清晰分离。除蔗糖外，蜜露还含有果糖和葡萄糖、海藻糖和异麦芽糖以及水苏糖和松三糖，其中松三糖为主要糖。研究表明，研磨的E. tiliae与蔗糖孵育产生与本研究中蜜露中发现的相同的糖。韧皮部汁液与蚜虫蜜露之间糖组成的巨大差异也已在柳树和云杉中得到证明。虽然两种植物物种的韧皮部汁液中仅发现蔗糖，但蜜露含有葡萄糖、果糖、蔗糖和松三糖及其他糖。应注意，不同昆虫物种的蜜露中糖组成可能不同，尽管植物来源相同，例如松三糖的量。取决于昆虫物种，韧皮部取食昆虫摄入的蔗糖在昆虫消化道中被酶水解并进一步转化为其他糖。海藻糖也已在以云杉为食的各种半翅目昆虫的蜜露中发现。它通常作为血淋巴中的糖，在昆虫飞行时使用。花蜜中的糖组成也与叶片或花朵的糖组成不同。花蜜含有果糖、葡萄糖和蔗糖以及极少量异麦芽糖和龙胆二糖/松二糖。曾讨论椴树花蜜是否可能含有甘露糖。然而，除果糖和葡萄糖外未检测到其他单糖，这与先前分析的结果一致。韧皮部与花蜜组成的差异是蜜腺中代谢过程的结果。例如，在花蜜分泌过程中，蔗糖被转化酶或其他裂解酶分解为葡萄糖和果糖。尽管棉子糖和水苏糖在椴树韧皮部汁液中运输，但这些寡糖在花蜜中未检测到或仅痕量检测到。这些差异表明花蜜形成过程中寡糖的选择性保留，这也在其他植物物种中得到证明。花蜜中少量异麦芽糖和龙胆二糖/松二糖令人惊讶，因为这些糖在花提取物中未检测到。然而，椴树花蜜中龙胆二糖/松二糖的出现已由Ga?i?等人证明。可以假设椴树花蜜中龙胆二糖的出现与挥发性物质的储存形式有关。Frérot等人表征了单萜或单萜酸的β-龙胆二糖酯，这些在蜂蜜中发现，在椴树花蜜中也有少量发现。龙胆二糖可能在这些糖苷裂解过程中出现。另一种可能性是它由传粉者糖代谢酶污染花蜜而形成。在研究中，椴树自由开放，被例如蜜蜂访问。然而，糖代谢酶的永久污染可以排除，因为采样后立即分析以及24 h后分析的花蜜中糖浓度没有显著变化。果糖和葡萄糖约占椴树蜜的65%（w/w），因此是主导化合物，果糖含量始终略高于葡萄糖含量。在来自法国和塞尔维亚的椴树蜜中也发现了相似水平的两种单糖。蜂蜜中的单糖可有不同来源。其中一些可能直接来自蜜蜂采集的花蜜或蜜露中的单糖。蜜蜂本身也可通过裂解花蜜或蜜露中的二糖或寡糖来贡献蜂蜜中的单糖。三糖含量在电导率高于0.8 mS cm?1的椴树蜜中显著高于低电导率蜂蜜。这表明电导率较高的椴树蜜可能由较大比例的蜜露生产，因为蜜露通常比花蜜含有更多寡糖。蜂蜜中所含的松三糖几乎完全来自蜜露，蜜露以松三糖为主要糖。然而，必须注意该蜜露的具体植物和动物来源无法精确确定，因为在不同蜜露以及不同蜜露蜂蜜中检测到松三糖水平升高。水苏糖含量在电导率高于0.8 mS cm?1的蜂蜜中也显著更高。椴树蜜中的水苏糖可来源于蜜露，但蜜蜂也从蔗糖产生水苏糖。在蜂蜜中发现的二糖和三糖中，曲二糖、麦芽酮糖、1-蔗果三糖和异麦芽三糖仅存在于蜂蜜中，而未在椴树组织、花蜜或蜜露中发现。这意味着这些糖主要由蜜蜂在蜂蜜生产过程中的酶活性产生。尽管叶片、花朵、花蜜、蜜露和两组蜂蜜中不同糖的水平各异，但基于糖的PLS-DA无法清晰分离两种蜂蜜组。原因可能是不同样品类型（叶片、花朵、花蜜、蜜露、蜂蜜）之间糖组成和含量的差异远大于两种蜂蜜类型之间的差异。此外，可以假设两种蜂蜜（低电导率和高电导率）均为花蜜基和蜜露基蜂蜜的混合物，尽管两种类型之间的各自比例不同。总体而言，总氨基酸浓度远低于糖浓度，最低浓度出现在细胞外液中，如花蜜作为植物分泌物或蜜露作为蚜虫分泌物。各种植物物种的花蜜通常（有一些例外）仅含有低浓度氨基酸。蚜虫非常有效地从所消耗的韧皮部汁液中吸收氨基酸，因为在不同物种的蜜露中仅发现约1%的吸收量。氨基酸组成在不同样品类型中不同，但不如糖组成差异大。尽管在椴树蜜中发现所有蛋白质源性氨基酸和一些非蛋白质源性氨基酸，但糖总和与氨基酸总和的比值约为1,000。在蜜蜂的饮食中，花蜜和蜜露，该比值甚至更高，花蜜约16,000，蜜露约30,000。因此，蜜蜂本身通过其唾液分泌物贡献蜂蜜中的氨基酸，尤其是脯氨酸的量，约占总氨基酸含量的一半。在两组椴树蜜中，脯氨酸浓度与先前椴树蜜分析中确定的相符。脯氨酸含量通常用作蜂蜜成熟度或掺假的 criterion。欧洲立法未规定最低值，但大多数成熟蜂蜜的脯氨酸浓度超过每kg蜂蜜180 mg。然而，不同蜂蜜类型以及单一蜂蜜类型内脯氨酸含量存在显著变化。除脯氨酸外，椴树蜜中苯丙氨酸的比例也显著高于其他样品类型，但不如脯氨酸高。在其他蜂蜜类型中也发现了相似结果。此外，蜂蜜中花粉粒中的氨基酸也可代表氨基酸来源，尽管非常小。曾尝试基于蜂蜜的氨基酸组成区分不同植物来源，但氨基酸含量的变异性如此之大，以至于除少数例外无法实现。这同样适用于本文检查的两组椴树蜜。这些在基于氨基酸的PLS-DA分析中无法清晰分离。无机离子在所有样品类型中均有发现，含量最高的是蜜露（约1 g/100 mL）。无机离子含量在所有样品类型中比糖类或氨基酸含量更相似。这可能是基于无机离子的PLS-DA未实现不同样品类型间清晰分离的原因。然而，在某些样品类型中，发现个别无机离子含量较高或较低，例如蜜露中磷酸盐比例较高。在其他蚜虫物种的蜜露中也发现高磷酸盐含量。蜜露蜂蜜比花蜜蜂蜜含有更多无机离子，这与蜜露中无机离子含量高于花蜜相符。电导率高于0.8 mS cm?1的椴树蜜中蜜露比例较高可能是该蜂蜜中无机离子含量较高的原因。这种较高的无机离子含量主要归因于K?、Na?、Mg2?、Ca2?、PO?3?和SO?2?的显著更高水平。先前研究已表明蜂蜜通常反映植物叶片中无机离子的组成，例如钾是最丰富的。由于无机离子由植物根系从土壤中吸收，其在蜂蜜中的组成和含量间接取决于土壤的矿物组成和地理区域。在一项使用蜜露蜂蜜的研究中，还表明无机离子组成似乎可用于确定蜂蜜的动物来源（蜜露生产者）。相比之下，蜂蜜中无机离子含量的差异在确定其植物来源方面不如预期有用。在有机酸的PLS-DA中，蜜露聚类与叶、花聚类以及花蜜和蜂蜜聚类之间可见清晰分离。蜂蜜具有轻微酸性，这可能归因于其有机酸含量。在有机酸中，葡萄糖酸是主导的。葡萄糖酸由葡萄糖氧化酶活性产生，该酶由蜜蜂或其共生微生物群添加到蜂蜜中。蜂蜜中还发现三羧酸循环的几种有机酸，但浓度较低，如苹果酸、柠檬酸、α-酮戊二酸或琥珀酸。椴树蜜中检测到的浓度在先前报道的其他植物来源蜂蜜的范围内。苹果酸含量在电导率高于0.8 mS cm?1的椴树蜜中高于低电导率蜂蜜。原因可能是高电导率蜂蜜中蜜露比例较高，且蜜露的苹果酸浓度远高于花蜜。蜜露蜂蜜通常比花蜜蜂蜜含有更高浓度的苹果酸。

结论部分，本研究调查了整个生产链——从植物组织（叶片和花朵）经花蜜或蜜露到椴树蜜——中15种糖类（单糖、二糖、三糖和四糖）、22种氨基酸、9种无机离子和5种有机酸的存在和浓度。椴树蜜的组成并不直接反映植物的代谢物和离子组成，还受蚜虫和蜜蜂代谢的影响。糖类的最大差异出现在不同样品类型之间。花蜜以葡萄糖和果糖的存在为特征。蜜露含有蚜虫代谢产生的二糖和寡糖，尤其是松三糖和水苏糖。蜂蜜还含有蜜蜂产生的额外二糖和寡糖。相比之下，氨基酸在花蜜和蜜露中浓度较低，蜂蜜中的氨基酸组成受蜜蜂显著影响，尤其是脯氨酸，还有苯丙氨酸。无机离子在样品类型之间显示相对较小的变化，组成主要反映植物组织中的组成。然而，有一些例外，如蜜露中较高的磷酸盐含量。有机酸含量在某些样品类型之间差异相当大。蜂蜜中的主导有机酸是葡萄糖酸，主要由蜜蜂产生，而在蜜露中苹果酸是主导有机酸。在基于所有分析代谢物和离子的PLS-DA中，叶、花聚类、花蜜聚类、蜜露聚类以及蜂蜜聚类之间可见清晰分离。在基于糖的PLS-DA中也观察到这些样品组之间的良好分离，其次是氨基酸、有机酸，而基于无机离子的PLS-DA中观察到最弱的分离。PLS-DA无法在两组蜂蜜之间实现足够分离，即使包括所有分析代谢物和离子。原因可能是不同样品类型之间的代谢物和离子含量差异远大于两种蜂蜜组之间的差异。两组蜂蜜的比较揭示，电导率高于0.8 mS cm?1的椴树蜜含有显著更高水平的二糖和寡糖（如松三糖）、无机离子（如PO?3?）和苹果酸，相较于低电导率蜂蜜。这些代谢物和离子的较高水平表明高电导率蜂蜜中蜜露基蜂蜜的比例高于低电导率蜂蜜。然而，必须指出蜜露的具体植物和动物来源无法精确确定，因为上述特征已在各种蜜露中发现，例如来自云杉或松树的蜜露。本研究结果为确定众多蜂蜜化合物的植物和动物来源提供了良好方法，从而有助于蜂蜜的真实性鉴定；然而，需要进一步研究以区分同一植物来源的不同类型蜂蜜。