《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：CDK4/6 inhibition suppresses mTOR activity and growth in lymphangioleiomyomatosis (LAM)
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细胞周期蛋白D1-细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）-Rb轴的失调是增殖性疾病和癌症的标志。CDK4/6与D型细胞周期蛋白形成异二聚体而被激活，其表达受促有丝分裂信号上调，主要通过RAS/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号转导级联实现。mTOR
细胞周期蛋白D1-细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）-Rb轴的失调是增殖性疾病和癌症的标志。CDK4/6与D型细胞周期蛋白形成异二聚体而被激活，其表达受促有丝分裂信号上调，主要通过RAS/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号转导级联实现。mTOR作为核心代谢感受器，整合生长因子、营养和能量状态信号，通过磷酸化S6激酶1（S6K1）和eIF4E结合蛋白1（4E-BP1）等关键底物促进合成代谢过程。mTOR在50%–75%的乳腺癌中异常激活，常通过PIK3CA、PTEN和TSC1/2基因的激活突变实现。帽依赖性翻译是控制编码生长因子和癌基因（包括细胞分裂关键调控因子细胞周期蛋白D1）的特定mRNA翻译的重要细胞现象。mTOR与细胞周期蛋白D1/CDK4/6之间的另一联系通过mTOR靶点4E-BP1实现。mTOR对4E-BP1进行层级磷酸化，先T37和T46，后T70和S65。高度磷酸化的4E-BP1从mRNA的5′帽释放eIF4E以启动帽依赖性翻译。值得注意的是，多项研究表明其他激酶如CDK4控制4E-BP1的磷酸化以刺激翻译，尤其在mTOR抑制剂耐药情况下。CDK4通过4E-BP1调控翻译的能力表明其作用超越经典磷酸化Rb驱动G1/S转换的功能。鉴于癌症中细胞周期和蛋白质合成的普遍失调，以及提示CDK4本身可磷酸化翻译抑制因子4E-BP1的直接机制证据，研究人员假设CDK4/6抑制可能以情境依赖方式对mTOR信号产生差异化效应。早期研究表明CDK4磷酸化4E-BP1并参与mTOR耐药。研究人员进一步假设对mTOR通路效应物的影响可能因mTOR通路活性状态而异。
**研究背景与问题提出**
细胞周期蛋白D1-细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（CDK4/6）-Rb轴的失调是增殖性疾病和癌症的标志。CDK4/6与D型细胞周期蛋白形成异二聚体而被激活，其表达受促有丝分裂信号上调，主要通过RAS/MAPK和PI3K/Akt/mTOR信号转导级联实现。在乳腺癌中，细胞周期蛋白D1过表达或扩增在超过50%的病例中可检测到，是CDK4/6抑制剂（CDK4/6i）在雌激素受体（ER）阳性亚型中取得成功的基础。CDK4/6i通过抑制细胞周期蛋白D1-CDK4/6复合物靶向G1至S细胞周期检查点，将癌细胞阻滞于G1期。mTOR作为核心代谢感受器，整合生长因子、营养和能量状态信号，通过磷酸化S6激酶1（S6K1）和eIF4E结合蛋白1（4E-BP1）等关键底物促进合成代谢过程。mTOR在50%–75%的乳腺癌中异常激活，常通过PIK3CA、PTEN和TSC1/2基因的激活突变实现。帽依赖性翻译控制编码生长因子和癌基因（包括细胞周期蛋白D1）的特定mRNA翻译。mTOR对4E-BP1进行层级磷酸化，先T37和T46，后T70和S65；高度磷酸化的4E-BP1从mRNA的5′帽释放eIF4E以启动帽依赖性翻译。多项研究表明CDK4控制4E-BP1的磷酸化以刺激翻译，尤其在mTOR抑制剂耐药情况下，表明CDK4的作用超越经典磷酸化Rb驱动G1/S转换的功能。在胰腺导管腺癌（PDAC）模型中，CDK4/6抑制存在内在耐药，表现为细胞周期蛋白D1和E1蛋白合成增加，而这一耐药基因表达程序可被mTOR抑制所抑制。这提示CDK4/6与mTOR信号通路可能深度交织，不仅在ER阳性乳腺癌中，也在淋巴管肌瘤病（LAM）这种以TSC1/2缺失导致mTOR过度激活为特征的罕见雌激素依赖性肺疾病中。鉴于癌症中细胞周期和蛋白质合成的普遍失调，以及提示CDK4本身可磷酸化翻译抑制因子4E-BP1的直接机制证据，研究人员假设CDK4/6抑制可能以情境依赖方式对mTOR信号产生差异化效应，且对mTOR通路效应物的影响可能因mTOR通路活性状态而异。
**研究内容与结论**
研究人员在多种遗传背景的细胞模型中系统评估了CDK4/6抑制剂palbociclib对mTOR信号通路的影响，包括PIK3CA突变型MCF7乳腺癌细胞、KRAS/BRAF突变型MDA-MB-231乳腺癌细胞、TSC2?/?和TSC2+/+小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、TSC2缺失的人源621-101细胞及TSC2重新表达的621-103细胞，并在新开发的LAM-CAM体内模型中验证了palbociclib对TSC2缺失肿瘤生长的影响。研究得出以下结论：CDK4/6抑制在多种遗传背景（PIK3CA突变、KRAS突变和TSC2缺失）下均能抑制mTORC1活性；CDK4/6与mTOR双重抑制在LAM细胞系模型中触发凋亡信号；palbociclib在LAM-CAM体内模型中减少TSC2缺失肿瘤负荷；该发现为将CDK4/6i重新用于LAM治疗提供了机制基础。
**关键技术与方法**
研究人员采用的主要技术方法包括：免疫印迹（immunoblotting）检测mTORC1/S6K1通路磷酸化及细胞周期调控蛋白表达；流式细胞术进行细胞周期分析（PI染色）和凋亡检测（Annexin V/7-AAD染色）；病灶形成实验（focus formation assay）评估接触抑制丧失和三维生长能力；鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验进行体内肿瘤生长评估，使用GFP转导的621-101细胞接种于受精鸡胚CAM，通过手动计数和GFP阳性细胞流式定量评估肿瘤负荷。细胞系来源包括：人乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）；人TSC2缺失细胞621-101和TSC2重新表达细胞621-103由Elizabeth P. Henske博士（布莱根妇女医院）惠赠；野生型和TSC2?/? MEFs由David J. Kwiatkowski博士（布莱根妇女医院）惠赠。
**研究结果**
**CDK4/6抑制在PI3K驱动的MCF7乳腺癌细胞中抑制mTORC1信号，双重CDK4/6和mTOR抑制克服CDK4/6i耐药**
在携带PIK3CA和CDKN2A突变、PI3K/Akt/mTORC1通路异常激活的MCF7细胞中，palbociclib处理抑制Rb磷酸化，确认有效的CDK4/6抑制，并诱导稳健的G1期阻滞。palbociclib单药处理72 h导致细胞周期蛋白E和A水平升高，而雷帕霉素单药降低其水平；palbociclib联合雷帕霉素处理逆转了这些细胞周期蛋白的诱导。CDK4/6抑制强烈降低mTORC1靶点（S6K1、CAD和4E-BP1）的磷酸化，并降低S6K1下游效应物（S6、eIF4B和PDCD4）的磷酸化，表明CDK4/6激活mTORC1且palbociclib可独立于雷帕霉素抑制mTORC1。雷帕霉素单药降低p62水平促进自噬，palbociclib单药增加p62水平；联合处理较雷帕霉素单药进一步增加p62水平，表明双重处理削弱雷帕霉素诱导的促生存自噬。雷帕霉素刺激LC3脂化，palbociclib未能刺激LC3脂化。联合组凋亡信号增加，表现为PARP剪切诱导、caspase 3降低和剪切caspase 3增加，表明CDK4/6抑制使mTOR通路激活的细胞对mTOR抑制敏感。
**CDK4/6抑制在MDA-MB-231乳腺癌细胞中抑制mTORC1和S6K1信号**
在Rb proficient且KRAS/BRAF突变驱动信号过度激活的MDA-MB-231细胞中，palbociclib有效抑制Rb磷酸化并诱导稳健的G1期阻滞。palbociclib增加细胞周期蛋白E和A水平，联合处理较palbociclib单药降低其水平。palbociclib对mTORC1活性发挥显著抑制作用：血清刺激诱导的S6K1 Thr389磷酸化被palbociclib降低，S6K1靶点包括mTOR Ser2448磷酸化显著降低，S6K1下游效应物S6、CAD和eIF4B也被强烈抑制，而Akt磷酸化基本不受影响。雷帕霉素单药诱导自噬，palbociclib单药导致p62显著降解提示自噬流完整；联合处理导致p62较各单药显著积累，同时LC3-B和p62均升高，提示联合处理并非进一步增强自噬而是药理学阻断自噬流。联合诱导的自噬阻断伴随向凋亡表型转变，总PARP和caspase-3水平降低。因此，CDK4/6抑制在MDA-MB-231细胞中减弱多个mTORC1和S6K1靶点，且mTOR抑制较palbociclib单药增强此效应。
**CDK4/6抑制在TSC2?/? MEFs中抑制mTORC1信号**
在TSC2缺失MEFs中，palbociclib处理导致稳健G1期阻滞并降低磷酸化Rb水平。在TSC2缺失MEFs中，palbociclib强烈抑制mTOR靶点磷酸化，包括磷酸化S6K1（T389）、磷酸化Akt（S473）、磷酸化CAD（S1859）和4E-BP1；S6K1下游靶点S6、mTOR（Ser2448）和CAD的磷酸化部分降低。在TSC2表达的野生型MEFs中，mTOR和S6K1靶点的磷酸化以时间依赖方式稳健降低，与CDK4/6在TSC2上游激活mTOR的概念一致。在两种细胞系中，延长palbociclib处理导致细胞周期蛋白E和A2代偿性上调；雷帕霉素单药降低这些细胞周期蛋白表达；72 h palbociclib联合24 h雷帕霉素完全逆转palbociclib诱导的细胞周期蛋白E和A2积累，使其表达低于基线水平。在TSC2缺失MEFs中，palbociclib单药显著抑制自噬（p62水平急剧增加），联合雷帕霉素诱导自噬并伴随PARP剪切诱导；在TSC2表达MEFs中，palbociclib单药未诱导自噬或凋亡，联合处理诱导自噬和凋亡（p62增加和PARP剪切）。
**CDK4/6抑制在人TSC2缺失细胞中减弱mTORC1但非S6K1信号**
在雌激素依赖性TSC2缺失LAM细胞621-101和TSC2重新表达621-103细胞中，血清释放增加Rb磷酸化，palbociclib有效抑制之。细胞周期分析确认palbociclib有效阻断621-101细胞G1/S转换：对照G1期为59.76%，palbociclib处理G1期达68.01%；雷帕霉素单药（63.15%）和联合处理（64.62%）也维持升高的G1群体。TSC2缺失621-101细胞中mTORC1基础活性高于621-103细胞，且对雷帕霉素敏感。palbociclib以时间依赖方式部分降低mTOR靶点磷酸化，包括S6K1（T389）和Akt（S473）；然而palbociclib未能降低其他mTORC1靶点如4E-BP1和S6K1靶点如CAD（S1859）、mTOR（S2448）、S6（S240/4；S235/6）的磷酸化，也未改变PDCD4的降解。在TSC2重新表达621-103细胞中，palbociclib对mTORC1或S6K靶点均无影响，强调其抑制作用对过度活跃mTOR情境具有选择性。
**Palbociclib在TSC2缺失细胞中限制自噬并促进凋亡**
雷帕霉素强烈诱导自噬，表现为p62水平降低和LC3AB-I向LC3AB-II转化。palbociclib增加p62积累且未能刺激LC3脂化，表明自噬抑制。palbociclib联合雷帕霉素导致LC3脂化增加和p62水平较雷帕霉素单药升高，提示palbociclib拮抗雷帕霉素诱导的自噬。此外，palbociclib促进PARP剪切和剪切caspase 3，表明诱导凋亡和抑制促生存信号。
**mTORC1和CDK4/6双重阻断协同抑制集落生长并诱导人TSC缺失621-101细胞凋亡**
病灶形成实验显示，未处理621-101细胞丧失接触抑制，形成密集多层病灶，平均集落直径为906.2 ± 277.5 μm（n = 43；中位数 = 852.2 μm）。雷帕霉素或palbociclib单药均显著降低平均集落直径：雷帕霉素降至398.3 ± 164.0 μm（n = 47；中位数 = 359.8 μm），palbociclib降至330.7 ± 113.8 μm（n = 56；中位数 = 330.7 μm）；两种单药之间集落直径减小无统计学显著差异。联合处理导致病灶大小和总数显著降低，多个高倍视野显示病灶完全缺失（0 μm），联合处理较任一单药显著更有效限制集落大小。Annexin V/7-AAD流式检测显示：对照细胞活性高（98.8%活细胞），凋亡极少（早期1.18%，晚期0.01%）；雷帕霉素单药诱导低水平凋亡（早期1.75%，晚期2%）；1 μM palbociclib单药诱导显著凋亡（早期10.13%，晚期8.15%）；雷帕霉素（20 nM）联合palbociclib（1 μM）凋亡高于雷帕霉素单药或对照（早期3.53%，晚期5.78%），但低于palbociclib单药，提示该浓度雷帕霉素发挥细胞保护效应。2 μM palbociclib单药诱导高水平凋亡（早期24.78%，晚期17.88%），与雷帕霉素联合诱导相当量凋亡（早期16.23%，晚期17.89%）。因此palbociclib单药或联合雷帕霉素均显著提高凋亡水平。
**CDK4/6抑制在LAM-CAM体内模型中限制mTOR驱动的肿瘤生长**
在LAM-CAM模型中，621-103细胞无法在CAM微环境中建立可检测肿瘤，而621-101细胞表现出肿瘤生长，强调LAM细胞对mTOR过度激活的依赖性。使用GFP转导的621-101细胞建立LAM-CAM肿瘤，接种前体外预处理24 h（对照、palbociclib 1 μM或雷帕霉素20 nM），于受精鸡胚E10接种150,000细胞，每3天重复给药，E16收获肿瘤。预处理细胞免疫印迹确认palbociclib降低Rb磷酸化，雷帕霉素抑制mTOR活性（S6 Ser240/244磷酸化降低）。切除肿瘤分析显示palbociclib或雷帕霉素处理较对照显著缩小肿瘤大小。手动计数确认palbociclib或雷帕霉素暴露后LAM细胞数显著减少。GFP阳性肿瘤细胞流式定量进一步验证两种处理组LAM细胞数较对照显著降低。这些结果确立CDK4/6抑制与mTOR阻断类似，在体内显著损害TSC2缺失LAM细胞的生存和致瘤能力。
**讨论与结论**
研究结果表明，除介导细胞周期阻滞外，CDK4/6抑制在多种细胞情境中直接调节mTOR信号。在乳腺癌模型中，ER阳性MCF7细胞在palbociclib处理后显示mTORC1直接底物的稳健抑制和S6K1效应物的部分抑制，与雷帕霉素协同降低细胞生存。在KRAS/BRAF突变MDA-MB-231细胞中，CDK4/6抑制也减弱mTORC1和S6K1活性。在TSC2缺失LAM细胞和MEFs中，palbociclib降低mTORC1直接靶点如p-S6K1 Thr389的磷酸化；相反，在TSC2野生型MEFs中，palbociclib抑制mTORC1直接靶点和下游S6K1输出，突出急性信号通路抑制对TSC2状态的依赖性。核心发现是CDK4/6抑制在多种遗传背景（PIK3CA突变、KRAS突变和TSC2缺失）下抑制mTORC1活性。CDK4/6被视为mTOR下游效应器，mTOR介导的细胞周期蛋白D1翻译驱动细胞周期；近期研究表明CDK4/6结合并磷酸化TSC2，从而将细胞周期进程与细胞生长耦合。研究结果强化了CDK4/6也作为mTORC1上游或平行调控因子的模型。在通路层面，联合CDK4/6和mTORC1抑制参与汇聚于细胞生存机制的互补调控轴。CDK4/6抑制导致磷酸化Rb显著降低触发细胞周期阻滞，同时导致自噬阻断（p62和LC3-II积累）并导致凋亡。直接抑制TSC2缺失LAM细胞中过度活跃的mTORC1关闭蛋白质合成和细胞生长信号同时促进自噬诱导。由于LC3和p62免疫印迹提供自噬改变的间接证据，未来研究需确定palbociclib干扰自噬流的确切阶段。靶向LAM中过度活跃mTOR信号的中心目标是将细胞结局从生长抑制转换为主动细胞死亡。雷帕霉素单药主要发挥细胞静止效应，而CDK4/6抑制作为强效合成致死伙伴。Annexin V结合实验显示palbociclib和雷帕霉素双重处理后早期和晚期凋亡显著增加。雷帕霉素单药主要维持细胞生存，加入palbociclib显著提高Annexin V阳性细胞百分比，确认双重抑制触发程序性细胞死亡而非短暂生长停滞。CDK4/6抑制与mTOR抑制类似，显著损害TSC2缺失LAM细胞的生存和致瘤能力，将CDK4/6抑制定位为独立于雷帕霉素mTOR抑制减弱LAM疾病中mTOR信号的潜在治疗策略。功能实验确认CDK4/6抑制深刻损害TSC2缺失细胞的长期致瘤和自我更新能力。病灶形成实验表明palbociclib单药减少病灶形成与雷帕霉素单药类似，联合显著抑制病灶形成，表明转化潜能破坏和失控克隆扩增丧失。这些体外观察在体内LAM-CAM模型中得到确认，palbociclib减少TSC2缺失肿瘤负荷，疗效与雷帕霉素相当。通过将自噬阻断与mTORC1抑制诱导的自噬应激并置，palbociclib和雷帕霉素联合破坏TSC2缺失细胞的适应性生存机制，主动转向抑制LAM细胞生长和凋亡。研究结果为在LAM和其他mTOR驱动恶性肿瘤中靶向CDK4/6-细胞周期蛋白D1轴提供了新颖机制依据。虽然CDK4/6抑制剂是ER+乳腺癌的既定治疗模式，数据提示其效用通过破坏细胞周期进程与合成代谢之间的关键互惠环路延伸至TSC2缺失情境。结果对LAM具有积极临床意义：当前LAM治疗几乎完全依赖西罗莫司（雷帕霉素），其稳定肺功能但非治愈性，停药后疾病进展。观察到的协同作用提示在当前标准治疗中加入CDK4/6抑制剂可能通过实现凋亡而非生长抑制并减少耐药来提高效率。虽然当前LAM-CAM实验证明palbociclib单药显著减少TSC2缺失肿瘤负荷，未来研究需评估联合CDK4/6和mTOR抑制在体内是否产生相加或协同效应。LAM-CAM模型提供快速体内系统评估TSC2缺失肿瘤生长，但其不成熟免疫系统和短观察期限制直接临床外推，因此未来需在哺乳动物LAM模型中评估长期疗效、安全性、激素调节和联合治疗策略。总之，本研究确定CDK4/6作为维持LAM特征性过度活跃mTORC1信号的代谢调控因子。通过交叉细胞周期和mTOR轴，双重抑制提供强效合成致死性，消除LAM细胞依赖的生存机制，该结果通过抑制病灶形成、增加Annexin V阳性凋亡和减少CAM肿瘤负荷得到验证。未来临床研究应在额外临床前模型中探索该联合方案的安全性和有效性，为TSC2缺失疾病患者提供更持久治疗选择提供依据。
