载褪黑素前体囊泡增强吉西他滨耐药胆管癌的吉西他滨应答：蛋白质组学与计算模拟研究

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Melatonin-loaded proniosomes enhance gemcitabine response in gemcitabine-resistant cholangiocarcinoma: Proteomic and computational insights

载褪黑素前体囊泡（melatonin-loaded proniosomes）增强吉西他滨（GEM）耐药胆管癌（cholangiocarcinoma, CCA）对GEM的应答：蛋白质组学（proteomics）与计算模拟（computational insights）见解。•基于麦芽糊精（maltodextrin）的前体囊泡改善了褪黑素（melatonin）的稳定性和渗透性。•MPN在两种储存条件下维持褪黑素含量超过6个月。•GEM + MPN-Low在耐药CCA中产生最强的肿瘤生长抑制。•联合治疗显著降低Ki-67且无明显毒性。•蛋白质组学和分子对接（molecular docking）确定MMP9和CDK2为候选褪黑素靶点。

一、研究背景。胆管癌（cholangiocarcinoma, CCA）是胆道系统侵袭性恶性肿瘤，具有明显分子异质性、诊断晚和临床结局差等特点；在东南亚，尤其是泰国东北部，致癌性肝吸虫Opisthorchis viverrini感染是重要病因。手术切除是长期生存的最佳选择，但可切除患者有限，晚期CCA主要依赖系统治疗。吉西他滨（gemcitabine, GEM）联合顺铂长期为晚期胆道癌化疗骨架，联合度伐利尤单抗（durvalumab）或帕博利珠单抗（pembrolizumab）等免疫检查点抑制剂可改善一线结局，但治疗耐药和疾病进展仍是主要临床挑战。GEM耐药涉及药物转运和代谢改变、DNA修复增强、凋亡逃逸、代谢重编程、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及促生存信号激活等。褪黑素（melatonin, MEL）是内源性吲哚胺，除昼夜节律调节外，还具有抑制增殖、促进凋亡、调节氧化和线粒体反应及影响治疗耐药相关信号等抗癌特性；在CCA模型中，褪黑素可抑制生长并促进凋亡，也可增强常规抗癌药活性，但其快速消除、广泛首过代谢和低口服生物利用度限制治疗应用。前体囊泡（proniosomes）是干态表面活性剂基前体囊泡系统，水化后形成niosomal囊泡，干态可改善储存稳定性，所得囊泡可包载不同理化性质化合物并增强药物分散和膜渗透。研究人员此前已证明麦芽糊精基前体囊泡平台可改善姜黄素递送并增强GEM耐药CCA模型中的抗肿瘤疗效，但前体囊泡递送能否增强褪黑素抗肿瘤活性并改善GEM耐药CCA对化疗的应答尚未确立。因此，本研究开发麦芽糊精基载褪黑素前体囊泡（MPN），评估其理化性质、储存稳定性、分子相互作用和离体黏膜渗透，并在GEM耐药CCA异种移植模型中评价单用及联合GEM的治疗活性；同时整合肿瘤蛋白质组学（proteomics，大规模蛋白表达分析）与人肝内CCA单细胞转录组图谱（single-cell transcriptomic atlas，单细胞水平基因表达图谱），结合网络药理学（network pharmacology，基于靶点网络和通路富集预测药物作用）、功能富集和分子对接（molecular docking，预测配体-受体结合构象与打分）筛选候选褪黑素相关靶点，并用分子动力学模拟（molecular dynamics simulation, MD，基于力场模拟复合物随时间运动）考察褪黑素–MMP9（matrix metalloproteinase 9，基质金属蛋白酶9）和褪黑素–CDK2（cyclin-dependent kinase 2，细胞周期蛋白依赖性激酶2）复合物稳定性。研究意义在于为GEM耐药CCA提供候选递送策略和可验证的分子线索。

关键技术方法概括（不超过250字）。研究人员制备麦芽糊精基MPN，表征包封率、载药量、粒径、多分散指数（PDI）、zeta电位、E-SEM形态、6个月储存稳定性及猪食管黏膜离体渗透；建立GEM耐药KKU-213BGemR细胞皮下异种移植BALB/cAJcl-nu小鼠模型（动物来源：Nomura Siam International Co., Ltd., Bangkok, Thailand；猪食管黏膜来自泰国孔敬当地屠宰场；人iCCA单细胞图谱来自CZ CELLxGENE数据库，选择细胞数最大的数据集）。采用shotgun蛋白质组学、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、MaxQuant/MetaboAnalyst、STRING/Cytoscape、SwissTargetPrediction、GO/KEGG富集、AutoDock对接及GROMACS MD/MM-GBSA分析。

二、研究结果。3.1 MPN的理化特征：通过DLS、E-SEM、包封率和MD模拟等，MPN为干态自由流动白色粉末，水化后主要形成球形囊泡，平均流体动力学直径134.87 ± 2.45 nm，PDI 0.514 ± 0.01，zeta电位?39.97 ± 2.38 mV，包封率81.39%，载药量44.29%；MD提示褪黑素主要经疏水作用与Span 60和胆固醇结合。3.2 MPN的稳定性与渗透性：通过6个月长期和加速储存及Franz扩散池猪食管黏膜渗透实验，MPN在两种条件下褪黑素含量接近完全保留；MPN稳态通量为0.7584 μg/cm²/h，游离褪黑素为0.04832 μg/cm²/h，约提高15.7倍。3.3 MPN的体内疗效：在GEM耐药KKU-213BGemR异种移植模型中，GEM + MPN-Low产生最强且一致的肿瘤生长抑制，Ki-67阳性细胞百分比和H-score显著降低；体重稳定，血清ALT和肌酐无显著组间差异；GEM单药和MEL单药组生存下降，但含MPN组及GEM + MPN-Low未见该下降。3.4 蛋白质组学分析显示耐药CCA蛋白质组的治疗相关重塑：shotgun蛋白质组学鉴定14,488个蛋白，PLS-DA显示未处理、GEM、MPN和GEM + MPN组分离；GEM + MPN与未处理组间存在差异丰度蛋白，top 35层次聚类及PPI网络显示治疗相关蛋白模块。3.5 单细胞映射：将差异蛋白对应基因映射到独立人iCCA单细胞图谱，UMAP和signature scoring显示上调和下调特征分布于恶性细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等多种细胞群，个别基因在恶性细胞或成纤维细胞中表达较突出。3.6 网络药理学：将预测褪黑素靶点与未处理耐药肿瘤蛋白交集，获得28个候选靶点；PPI hub分析排序前10为STAT3、MMP9、ROCK1、CDK2、CCNA1、JAK2、ADAM10、AGTR1、RAF1和MAPT；GO/KEGG富集显示癌症通路等富集。3.7 分子对接：对8个具可用结构的hub靶点对接，褪黑素与MMP9结合能?7.69 kcal/mol、与CDK2为?7.21 kcal/mol，接近参考配体NFH（?7.89 kcal/mol）和SU9516（?7.68 kcal/mol）；红对接验证结合位点定位。3.8 褪黑素–MMP9与褪黑素–CDK2复合物的分子动力学：5个独立100 ns模拟中，褪黑素在MMP9的S1′口袋稳定结合，配体RMSD与NFH相近，未螯合催化锌；在CDK2中占据ATP口袋但稳定性低于SU9516，且一个重复中离开口袋；MM-GBSA和相互作用分析提示MMP9模型姿态持久性更高。

三、讨论总结与研究结论翻译。讨论部分指出，MPN具备干粉、储存稳定和离体渗透增强等特征，但PDI较宽、E-SEM粒径与流体动力学粒径不可互换，储存实验仅测褪黑素含量；与姜黄素前体囊泡相比不能简单判定优劣。离体通量提高不能直接换算为血浆暴露，口服后仍受胃液、肠黏液、胆盐、消化酶和首过代谢等影响。GEM + MPN-Low抗肿瘤作用最强，但给药方案不匹配且未测药代动力学（pharmacokinetics, PK，药物吸收分布代谢排泄），不能将差异单独归因于前体囊泡，也不能称为协同；空白前体囊泡无活性，不支持载体本身抗肿瘤。短期体重、生存、ALT和肌酐结果仅提示短期耐受性，不等于全面安全性。SHH丰度降低与肿瘤生长和Ki-67下降同时出现，但未证明褪黑素直接抑制Hedgehog通路；单细胞映射提供细胞类型背景，不证明免疫介导机制；网络药理学、对接和MD均为计算预测，需直接结合、酶活、细胞靶点 engagment和遗传/药物扰动等实验验证。局限包括免疫缺陷小鼠皮下模型、未测系统及瘤内褪黑素暴露、人数据库搜索低估鼠基质蛋白、单细胞图谱非治疗特异性、Ki-67仅3个肿瘤/组等。研究结论翻译：麦芽糊精基褪黑素前体囊泡在测试储存条件下6个月保留褪黑素含量，并较游离褪黑素增加离体黏膜通量。GEM + MPN-Low在GEM耐药CCA异种移植模型中与最强肿瘤生长抑制和Ki-67表达降低相关，15天治疗期间血清ALT或肌酐无可检测变化。蛋白质组学分析识别治疗相关变化，包括SHH丰度降低，映射到独立人iCCA图谱提供细胞类型背景。对接和重复MD模拟识别褪黑素与MMP9和CDK2的候选相互作用，其中MMP9模型姿态持久性更高。这些计算发现需实验验证；需开展药代动力学研究、功能靶点测定及具有适当免疫能力的原位模型，以确定暴露、机制和可重复性。