《Bioprinting》：Screening ADA-GEL Based Hydrogel Formulations and Bioprinting Conditions for Myoblast Encapsulation and Alignment
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海藻酸二醛-明胶（alginate dialdehyde-gelatin, ADA-GEL）基水凝胶的材料性能具有固有的可调性，使其能够作为生物墨水（bioink）应用于组织模型的生物制造（biofabrication）。尽管具有这种巨大潜力，但ADA-GEL
海藻酸二醛-明胶（alginate dialdehyde-gelatin, ADA-GEL）基水凝胶的材料性能具有固有的可调性，使其能够作为生物墨水（bioink）应用于组织模型的生物制造（biofabrication）。尽管具有这种巨大潜力，但ADA-GEL水凝胶在骨骼肌细胞生物打印（bioprinting）中的应用仍然有限，这主要是由于缺乏对负载肌肉细胞的ADA-GEL基墨水可打印性（printability）和生物相容性（biological compatibility）的系统分析。为了解决这一知识空白，研究人员在此开展了不同配方ADA-GEL水凝胶的物理和生物学特性研究，并建立了全面的C2C12小鼠成肌细胞（C2C12 mouse myoblasts）3D生物打印（3D bioprinting）工艺。研究人员首先研究了总聚合物浓度、ADA与GEL比例以及制备方法对墨水可打印性的影响，并在包入肌肉细胞后分析了细胞的活力（viability）和形态。结果表明，2.5%ADA-5%GEL（w/v）配方，其中GEL在37°C（37_ADAGEL）或80°C（80_ADAGEL）下处理，提供了可打印性和生物学特性的良好组合。下一步，研究人员优化了使用锥形（conical）和圆柱形（cylindrical）打印喷嘴的打印工艺，以在生物打印过程中维持C2C12细胞的活力和定向。孵育7天后，37_ADAGEL（锥形）表现出最高的细胞活力。到第14天，37_ADAGEL（锥形）和80_ADAGEL（锥形）均显示出比其圆柱形对应物更高的活力，而37_ADAGEL（锥形）还额外影响了细胞沿打印方向的定向。最后，验证了含有ADA-GEL和硅酸盐基生物活性玻璃纳米颗粒（silicate-based bioactive glass nanoparticles）的复合墨水的可打印性，其中前一步骤优化的生物墨水（含颗粒，37_ADAGEL_NP）与其80°C对应物相比进一步显示出更高的细胞活力和定向性。本研究系统筛选了ADA-GEL墨水配方和3D生物打印工艺，确定了增强生物制造结构中成肌细胞活力和定向的有效配方和最佳打印设置。
骨骼肌组织工程领域，三维（3D）生物打印（3D bioprinting）技术作为先进的增材制造手段，通过逐层沉积负载细胞的水凝胶来构建组织替代物及体外组织模型。其中，挤出式生物打印（extrusion-based bioprinting）因可处理宽范围粘度的生物墨水（bioink）并支持高细胞密度打印，同时具备相对较低的设备成本和良好的可扩展性，展现出显著优势。海藻酸二醛-明胶（alginate dialdehyde-gelatin, ADA-GEL）基水凝胶因其固有的生物相容性、与天然细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相似的结构特性、剪切稀化（shear-thinning）行为、可调控的降解时间与刚度，被认为是极具潜力的生物墨水材料体系。然而，ADA-GEL水凝胶在骨骼肌细胞生物打印中的应用仍受限于缺乏系统性研究，尤其缺乏将生物墨水配方、水凝胶制备工艺与打印参数（如喷嘴几何形状）相关联，并综合评估其可打印性与C2C12成肌细胞活力及结构定向的综合性工作。此前虽有研究探讨了ADA氧化程度、交联策略及明胶加热条件对材料性能的影响，但多集中于材料学表征，对细胞生物学行为的考察不足；亦有研究指出特定配方下细胞生长受限及打印丝逃逸现象，提示需进一步优化生物墨水组成。因此，系统筛选ADA-GEL配方并优化3D生物打印工艺，对于推动该材料在骨骼肌组织工程中的应用具有重要意义。
研究人员采用小鼠C2C12成肌细胞系作为模型细胞，系统设计了六种ADA-GEL水凝胶配方，通过调控总聚合物浓度、ADA与GEL比例以及明胶预处理温度（37°C与80°C）制备系列样品。研究采用网格结构测试（grid structure test, GST）与对角交叉比（diagonal crossing ratio, DCR）评价可打印性，利用流变仪测定储能模量（storage modulus, G'）、损耗模量（loss modulus, G''）及复数粘度（complex viscosity, |η*|）。通过监测37°C培养条件下样品质量变化分析溶胀与降解行为，并采用微压缩测试评估有效模量（effective modulus）。在生物打印阶段，研究使用内径250 μm的锥形与圆柱形喷嘴进行挤出式3D打印，以2×10
6 cells/mL密度包封细胞。通过WST-8法（water-soluble tetrazolium salt WST-8 assay）检测细胞活力，结合鬼笔环肽（phalloidin）与Draq5免疫荧光染色及共聚焦显微镜成像，运用结构张量分析（structure tensor analysis）量化细胞骨架相对于打印方向的取向角度。此外，研究还构建了掺入铈（Ce）和硼（B）掺杂硅酸盐基生物活性玻璃纳米颗粒（nanoparticles, NP）的复合生物墨水，验证其可打印性与生物学功能。
3.1. ADA-GEL水凝胶配方
3.1.1. 六种ADA-GEL水凝胶的无细胞可打印性与流变学性能
通过无细胞网格结构打印测试与流变学测量，研究人员发现80_low配方因粘度过低且缺乏形状保真度而不适用于多层结构打印；37°C制备的明胶（37_）相比80°C（80_）具有略高的结构保真度、对角交叉比及储能模量和损耗模量，而高浓度配方（37_high和80_high）虽能赋予结构弹性主导行为，但需要超过140 kPa的过高打印压力，不利于维持细胞活力。综合可打印性与低打印压力需求，中等浓度的37_medium和80_medium被选为后续研究对象。
3.1.2. 溶胀率与失重行为
通过28天的质量监测发现，所有配方在前24至72小时均出现明显溶胀，高浓度配方溶胀率最高；随后各配方均发生逐渐质量下降，表明通过未交联聚合物释放、聚合物水解及网络碎裂导致降解。28天后，高浓度配方仍保留超过100%初始质量，而中低浓度配方降解至低于初始质量，其中80_low降解最严重。对于骨骼肌组织工程，中低浓度配方的降解曲线更有利于支持肌细胞生长。
3.1.3. 2D薄膜的生物学研究
将C2C12细胞接种于六种ADA-GEL水凝胶表面培养7天，结果显示所有配方均支持细胞存活，且各组成间活力无显著差异。然而，细胞形态存在明显差异：80_low上的细胞黏附与铺展最有限，37_high上的细胞铺展也相对受限，而其余四种配方（尤其是中等浓度配方）支持了细胞的广泛铺展。
3.2. ADA-GEL与复合生物墨水的打印技术及生物打印
3.2.1. ADA-GEL与复合水凝胶的表征
对纯ADA-GEL及含纳米颗粒（NP）的复合水凝胶进行10天的溶胀与降解评估显示，短链GEL配方（80_）及含NP的配方溶胀更为显著，而0.1%（w/v）的NP对水凝胶质量变化无显著影响。力学测试表明，37°C制备的样品在整个孵育期内均表现出高于80°C样品的有效模量（effective modulus），且添加NP对刚度无显著影响；所有配方在10天内均保持了结构完整性。
3.2.2. ADA-GEL与复合水凝胶的可打印性
使用锥形与圆柱形喷嘴（250 μm内径）打印发现，圆柱形喷嘴虽能提供更佳的尺寸保真度（更高DCR值），但需要比锥形喷嘴高2至3倍的打印压力（例如37_ADAGEL从锥形喷嘴的70-80 kPa增至圆柱形喷嘴的225 kPa），这可能构成对细胞的潜在损伤环境。两种喷嘴在纯ADA-GEL与其含NP复合墨水的可打印性方面未表现出显著差异，但37°C配方的DCR值仍优于80°C配方。
3.2.3. 细胞包封生物墨水的3D培养生物打印
生物打印实验表明，37_ADAGEL（锥形喷嘴）在第3天和第7天均表现出最高的细胞活力，锥形喷嘴产生的宽流道与渐变收缩结构缩短了细胞经历高剪切应力的时间，从而减少了细胞活力损失。培养至第14天，两种37_ADAGEL锥形喷嘴条件仍优于其圆柱形对应组。细胞取向分析显示，37_ADAGEL（锥形喷嘴）具有最低的角度偏差（13±0.3°），表明其诱导了最高程度的沿打印方向细胞定向。对于复合墨水，37_ADAGEL_NP在培养7天后表现出比80_ADAGEL_NP更高的细胞密度，且角度偏差（16±6°）低于80_ADAGEL_NP（27±8°）。
研究讨论指出，80_low配方因聚合物浓度过低且明胶链最短，导致打印性能差且细胞铺展受限；37_high和80_high则因需要过高打印压力而不适用于活细胞打印。中等浓度配方在打印分辨率、低打印压力、易处理性及细胞活力与铺展方面表现均衡。圆柱形喷嘴虽提高了打印精度，但伴随的高打印压力可能构成对细胞的严酷环境；相比之下，锥形喷嘴不仅维持了较高的细胞活力，还在细丝足够薄时促进了整个厚度范围内细胞的定向排列。细胞沿打印方向的取向被认为源于挤出过程中聚合物链的取向，且打印后交联过程限制了分子重新取向，使细胞得以维持伸长形态；丝中心取向降低则归因于中心区域剪切应力较低以及边缘交联更早启动导致中心分子重排。对于含NP的复合墨水，37°C配方同样优于80°C配方。该研究系统整合了六种文献配方并进行对比，为ADA-GEL在骨骼肌细胞打印中的选择提供了直接依据。
本研究表明，2.5% ADA-5% GEL（w/v）配方，特别是37°C制备的配方（37_ADAGEL），结合锥形喷嘴，是所研究的ADA-GEL水凝胶体系和打印条件中最适合C2C12细胞生物打印的选择。80_low配方因打印性能差和细胞铺展受限而被排除；37_high和80_high则需要过高打印压力，不适用于活细胞打印。37_medium和80_medium配方在打印分辨率、低打印压力、易处理性、细胞活力和铺展方面满足要求。圆柱形喷嘴通常导致更高的打印精度但需要更高压力；37_ADAGEL和80_ADAGEL使用锥形喷嘴打印产生的细胞活力高于其圆柱形对应组。锥形喷嘴在培养7天后导致更高的细胞相对于打印方向的定向。对于含硅酸盐纳米颗粒的生物墨水，37_ADAGEL_NP在7天培养期间表现出比80_ADAGEL_NP更高的细胞密度。该研究解决了肌细胞生物打印用生物墨水的物理与生物学要求，为ADA-GEL基生物打印在肌肉组织工程中的进一步研究提供了基础。
