《Bioresource Technology》：Valorizing watermelon rind waste into Plant-Based scaffolds for Proof-of-Concept cultivated meat production in a dynamic Fixed-Bed bioreactor
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将西瓜皮废弃物（watermelon rind waste）增值化制备植物基支架（valorized decellularized plant scaffolds, vDPS），为培养肉（cultivated meat, CM）的可持续生物工艺提供了可行方案。
将西瓜皮废弃物（watermelon rind waste）增值化制备植物基支架（valorized decellularized plant scaffolds, vDPS），为培养肉（cultivated meat, CM）的可持续生物工艺提供了可行方案。研究人员以Tween-20替代Triton-X作为更安全且有效的脱细胞表面活性剂。固定床反应器（fixed-bed bioreactor, FBR）中的动态培养促进了肌母细胞的覆盖与分化。本研究证明了利用FBR进行培养肉生产规模放大的概念验证（proof-of-concept, POC）。从2019年至2050年，全球对动物性食品的需求预计将增长45%至55%，这一增长与人口增长、城市化生活方式以及家庭收入和生活水平的提升密切相关。培养肉作为替代蛋白领域的新兴选项，通过在受控环境中培养动物细胞以生成可食用组织，避免了传统屠宰过程，有助于缓解伦理关切、降低环境影响并改善食品安全。然而，培养肉的大规模商业化仍面临技术与经济挑战，其中与天然肉类的价格差距是消费者接受度的关键障碍。固定床反应器因其能够实现连续营养与气体交换、均匀流动分布及有效细胞截留，成为大规模细胞培养的有前景平台。理想的培养肉支架需具备生物相容性、结构完整性、可食用性、经济性与可持续性。本研究将常被废弃的西瓜皮（Citrullus lanatus）作为低成本、可食用的支架来源，并以Tween-20替代传统毒性表面活性剂Triton X-100进行脱细胞处理，以提升食品安全性并减少环境危害。研究采用小鼠肌母细胞C2C12细胞系，在Ascent固定床反应器系统的动态条件下评估vDPS支持细胞黏附、增殖与分化的能力。据研究人员所知，这是首次在放大规模生物反应器系统中展示废弃物增值化植物基支架用于培养肉生产的概念验证。除细胞相容性与分化外，研究还考察了培养肉原型产品的营养特性与烹饪特性。总体而言，本研究构建了一个整合废弃物增值化、更安全表面活性剂替代及固定床生物反应器动态受控培养的系统性框架，为培养肉相关生物工艺提供了概念验证，展示了可持续材料降低生产成本并支持未来规模放大的潜力，同时为环境友好的培养肉生物制造工艺开发作出贡献。
论文主体解读
一、研究背景与问题
2019年至2050年间，全球对动物性食品的需求预计将增长45%至55%，这一趋势源于人口增长、城市化进程以及居民收入和生活水平的持续提高。在此背景下，培养肉（cultivated meat, CM）作为替代蛋白领域的新兴方向，通过在受控环境中培养动物细胞生成可食用组织，有望规避传统屠宰的伦理争议、降低环境负担并提升食品供给安全。然而，培养肉的大规模商业化仍面临显著的技术与经济瓶颈，其中与天然肉类的价格差距是消费者接受的关键障碍，而这一成本差距很大程度上源于原本面向生物医学或组织工程设计的细胞培养技术在食品生产规模下的适配困难。此外，此类系统对卫生和操作条件要求严苛，进一步增加了规模放大与成本管控的复杂性。因此，开发一种既能支持高密度细胞生长、又能兼顾成本效益与食品安全的可扩展生物工艺，是培养肉生物制造领域的核心挑战。
二、研究内容与核心结论
针对上述问题，本研究提出了一种创新策略：将西瓜皮（Citrullus lanatus）这一常被废弃的农业副产物重新利用，作为低成本、可食用的植物基支架材料用于培养肉生产。为提升食品安全性并减少环境危害，研究以Tween-20替代传统脱细胞工艺中使用的毒性表面活性剂Triton X-100。研究进一步利用小鼠肌母细胞C2C12细胞系，在Corning Ascent固定床反应器（fixed-bed bioreactor, FBR）系统的动态培养条件下，系统评估了增值化脱细胞植物支架（valorized decellularized plant scaffolds, vDPS）支持细胞黏附、增殖与分化的能力。据研究人员所知，这是首次在放大规模生物反应器系统中展示废弃物增值化植物基支架用于培养肉生产的概念验证（proof-of-concept, POC）。研究还考察了培养肉原型的营养特性与烹饪特性，构建了整合废弃物增值化、安全表面活性剂替代及动态受控培养的系统性框架，为培养肉相关生物工艺的规模放大提供了重要参考。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键方法：从当地杂货店获取西瓜皮，仅取红色果肉与白绿色层之间的白色部分（即“rind”），将其切割为直径10–12 mm、高度3–5 mm的圆柱体。脱细胞处理依次采用1% w/v十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulphate, SDS）溶液动态透析3–4天，随后分别以1% v/v Triton X-100、1% v/v或10% v/v Tween-20替代处理，再经100 mM氯化钙（CaCl?）处理、70%乙醇处理、去离子水冲洗5天、冷冻干燥后储存于?20°C。支架表征包括DNA含量定量（CyQUANT? DNA检测试剂盒）、Micro-CT孔隙率分析、压缩杨氏模量力学测试以及SDS和Tween-20残留分析（分别采用亚甲基蓝法和考马斯亮蓝法）。细胞实验采用C2C12细胞系（ATCC? CRL–1772?，第6–8代），在Ascent FBR System 5中进行动态培养，以3×10?细胞/支架的密度接种，增殖4天后更换分化培养基（含2%马血清）继续培养3天。细胞活力通过Live/Dead荧光染色、PrestoBlue代谢检测和CCK-8增殖检测评估，湿细胞质量通过校准曲线计算。代谢组学分析采用BioProfile 400分析仪每日检测培养基中谷氨酰胺、葡萄糖、乳酸和铵离子浓度。分化评估通过免疫荧光染色（肌球蛋白重链MHC、结蛋白Desmin、F-actin）结合共聚焦显微镜成像，并使用Drylab AI平台进行肌管长度测量和融合指数（fusion index）计算。
四、研究结果
4.1 脱细胞支架表征
DNA定量结果显示，经三种脱细胞条件（1% Triton X-100、1% Tween-20、10% Tween-20）处理后的支架DNA含量均显著低于未处理原料，表明脱细胞过程有效去除了细胞遗传物质。Micro-CT分析揭示了vDPS的多孔三维结构，为细胞附着和营养扩散提供了充足空间。力学测试表明脱细胞处理后的支架保持了足够的压缩模量以支撑细胞培养过程中的结构完整性。表面活性剂残留分析确认了洗涤流程的有效性，为支架的食品安全性提供了保障。
4.2 动态培养中的细胞增殖
在Ascent FBR System 5中，300个vDPS支架经Corning Synthemax? II包被后装入反应器，形成约40 mm高、60 mm直径的填充床，总体积约113 cm3，支架装载密度约2.65个/cm3。C2C12细胞以3×10?细胞/支架密度接种，经60分钟附着期后恢复培养基循环。PrestoBlue代谢检测显示，培养第7天各层支架均表现出显著的代谢活性，表明细胞在动态条件下成功增殖并覆盖支架表面。Live/Dead荧光染色进一步确认了支架上细胞的高存活率。CCK-8增殖检测结果与PrestoBlue数据一致，共同证实了vDPS在FBR动态培养条件下支持C2C12细胞增殖的能力。
4.3 肌管分化与融合
免疫荧光染色结果显示，经7天培养（4天增殖+3天分化）后，vDPS上形成了表达肌球蛋白重链（MHC）和结蛋白（Desmin）的肌管结构，F-actin染色呈现典型的肌纤维细胞骨架形态。通过Drylab AI平台对60条独立肌管进行纵向追踪测量，获得了肌管长度数据。融合指数（fusion index）通过计算MHC阳性肌管区域内（≥3个细胞核）的细胞核占总细胞核的比例得出，量化了肌母细胞融合形成多核肌管的效率。这些结果共同表明，vDPS在FBR动态培养条件下不仅支持细胞增殖，还能有效促进肌母细胞向成熟肌管的分化。
4.4 代谢物动态监测
每日培养基代谢物分析显示，在7天培养期间，葡萄糖和谷氨酰胺浓度持续下降，而乳酸和铵离子浓度相应上升，反映了细胞活跃的代谢活动。这些代谢趋势与细胞增殖和分化的时间进程相吻合，为FBR系统内细胞代谢状态提供了实时监测数据，验证了反应器系统支持高密度细胞培养的可行性。
五、讨论与结论
本研究通过将西瓜皮废弃物增值化为植物基支架，并在固定床生物反应器中实现动态培养，成功展示了培养肉生产的概念验证。Tween-20作为脱细胞表面活性剂的有效替代，在保证脱细胞效率的同时提升了支架的食品安全性，降低了环境危害。FBR系统提供的连续营养与气体交换、均匀流动分布和有效细胞截留，支持了支架上C2C12细胞的高密度生长与肌管分化。研究结果表明，废弃物增值化策略能够显著降低支架相关成本，而支架成本是培养肉生产成本的重要组成部分。本研究首次在放大规模生物反应器系统中验证了废弃物增值化植物基支架的可行性，为培养肉生物工艺的规模放大提供了系统框架。研究结论指出，可持续材料的应用有望降低培养肉生产成本并支持未来规模化生产，同时为环境友好的培养肉生物制造工艺开发奠定了基础。
