口腔链球菌比较敏感性景观：产生菌相关抑制活性的表型框架

《Applied Microbiology》：Comparative Susceptibility Landscapes Among Oral Streptococci: A Phenotypic Framework for Producer-Associated Inhibitory Activity

　　

细菌素（bacteriocin）研究传统上侧重于产生抑制性肽的生物体，而对微生物群落内对这些抑制活性的敏感性分布关注相对较少。本研究利用一组确定的十株历史上已表征的细菌素产生链球菌和46株指示菌，考察了S. anginosus、S. mitis和S. pyogenes之间的比较敏感性。延迟拮抗试验（deferred-antagonism assay）在两个独立实验场合分别进行，每次运行检查全部460个产生菌-指示菌组合。敏感性采用基于抑制圈特征的序数四分类系统进行评分。所得敏感性模式具有高度可重复性，实验运行间精确分类一致率为93.7%，在一个序数类别内的一致率为97.8%。所检查的分离株在产生菌面板中表现出敏感性和降低敏感性的选择性组合，而非简单的敏感性连续体。特别是，12株S. anginosus分离株对面板中代表的两种SalA相关产生菌活性均无抑制（每次运行均为0/12），同时对若干替代性产生菌相关活性仍保持敏感。研究人员使用术语比较敏感性景观（Comparative Susceptibility Landscape, CSL）来描述这种多维的、依赖于面板和试验的敏感性表型。CSL本身并不鉴定分子免疫机制或证明生态相互作用，而是提供一个结构化的表型框架，从中可以发展机制性和生态性假设。

研究背景方面，细菌素是核糖体合成的抗菌肽或蛋白质，可介导占据共享生态位的细菌之间的干扰竞争。在口腔链球菌中，细菌素产生已有充分文献记载，唾液链球菌（S. salivarius）通过其多样的salivaricin系统提供了突出例子。然而，细菌素产生的生态后果不仅取决于哪些生物体产生抑制性肽，还取决于暴露于这些肽的生物体的敏感性。细菌可能在对特定细菌素的耐受能力上存在显著差异，同时对其他细菌素仍保持敏感。因此，肽介导竞争的潜在效应取决于竞争群落内选择性敏感表型的分布，而非仅仅取决于细菌素产生的有无。这一区别在口腔中尤为重要，因为多种链球菌物种和菌株占据重叠的生境，且存在多样的细菌素相关系统。此前，Tagg和Bannister开发了一种"指纹图谱"方案，根据链球菌的细菌素样抑制物质产生（P分型）和对定义标准产生菌株所产生抑制活性的敏感性（S分型）进行表征。Tompkins和Tagg随后考察了天然唾液链球菌种群中敏感性的生态意义，报道携带高比例细菌素产生菌株的个体同时携带较高比例的相对 resistant 伴随革兰阳性球菌。本研究重新审视历史P/S方法中的敏感性组分，重点从产生菌类型鉴定转向跨多种产生菌相关抑制表型的敏感性配置。研究旨在确定跨定义十株产生菌面板的敏感性模式在独立实验运行间是否可重复；比较三个当代链球菌组之间的敏感性谱配置；鉴定与特定产生菌相关抑制活性相关的选择性敏感性或降低敏感性模式；确定这些比较表型是否为生成关于其分子决定因素和潜在生态意义的可检验假设提供有用基础。研究结论表明，对定义链球菌抑制活性库的敏感性可构成可重复的多维表型。在所检查的产生菌和指示菌株中，敏感性是选择性的，而非代表从细菌素敏感到普遍抗性的简单连续体。研究人员使用术语CSL来描述跨定义产生菌库的比较敏感性的结构化表示。CSL是一种依赖于面板和试验的表型框架；它本身并不鉴定导致降低敏感性的分子机制或证明生态相互作用。所观察到的敏感性配置，特别是S. anginosus分离株对SalA相关产生菌活性的选择性降低敏感性，提供了关于潜在分子决定因素及其潜在生态意义的可检验假设。解决这些机制将需要基因组解析分析、肽特异性实验以及最终的群落水平研究。更广泛的含义是，细菌素介导的竞争可能不仅由哪些生物体产生抑制性肽来提供信息，还由哪些生物体对其保持不受影响来提供信息。该表型指明了研究方向。

在技术方法方面，研究人员采用了基于Tagg和Bannister方法及Tompkins和Tagg敏感性谱分析程序的改良延迟拮抗试验，在含5%羊血的CABCa琼脂上进行，产生菌以1 cm宽直径划线接种，37 °C、5% CO2培养18 h后氯仿蒸气暴露30 min并通风30 min，指示菌以棉拭子垂直于产生菌生长线划线，再次培养18 h后按抑制圈特征进行四分类序数评分（?、+、++、+++）。全部460个产生菌-指示菌组合在两个独立实验运行中各检测一次，共920个观察。一致性评估采用精确分类一致率、一个序数类别内一致率及Cohen's κ统计（包括未加权和序数加权形式）。比较敏感性分析采用基于距离的多变量分析，包括PERMANOVA（9999次置换）和主坐标分析，以物种身份作为分析分组变量，对37株当代指示菌（12株S. anginosus、12株S. mitis、13株S. pyogenes）进行分析，历史指示菌I1–I9单独保留。PERMDISP作为离散度的补充评估，Holm校正的成对PERMANOVA用于评估指示菌组间差异。阳性相互作用率的95%置信区间通过聚类bootstrap（20,000次重采样）估计。计算分析使用Python 3.13.5及NumPy、pandas、SciPy和statsmodels实现。样本来源方面，S. mitis菌株选自Mogens Kilian提供的收藏，S. pyogenes菌株为Lewis Wannamaker收藏的参考分离株，代表已建立的M血清型背景，S. anginosus分离株来源于但尼丁学龄儿童口腔链球菌研究， species鉴定在作者实验室通过API 20 Strep完成。九株历史指示菌为原始链球菌敏感性指纹图谱框架的组成部分。

研究结果方面，第一，比较敏感性表型的可重复性。十株产生菌在两个独立实验运行中分别对全部46株指示菌进行检测，产生每次运行460个观察、共920个观察。在460个匹配的产生菌-指示菌组合中，两次运行精确分类一致431个观察（93.7%），另有19个观察差异在一个序数类别内，一个类别内一致率为450/460（97.8%）。共29个不一致观察：19个差异一个类别，8个差异两个类别，2个差异三个类别。Cohen未加权κ为0.904，线性加权κ为0.939，二次加权κ为0.959。这些结果表明两次独立试验之间分类敏感性表型具有高水平可重复性。第二，跨产生菌库的选择性敏感性模式。所检查的分离株并非沿从普遍敏感到普遍不敏感的简单连续体分布，个体指示菌在产生菌库中表现出抑制和非抑制的组合。在37株当代指示菌中，没有分离株对全部十种产生菌相关活性完全不敏感； conversely，一株分离株P3（M49）在两次实验运行中对全部十株产生菌均呈阳性反应。当代面板中个体分离株每次实验运行对2至10种产生菌相关活性呈阳性反应。K12相关活性抑制全部12株S. anginosus、全部12株S. mitis和全部13株S. pyogenes分离株。相比之下，面板中代表的两种SalA相关S. pyogenes产生菌活性在两次实验运行中均未抑制任何12株S. anginosus分离株，而S. anginosus分离株仍对若干其他产生菌相关活性敏感。M18相关活性每次运行抑制10/12株S. mitis分离株和全部13株S. pyogenes分离株，而未抑制任何12株S. anginosus分离株。第三，S. anginosus分离株的选择性降低敏感性。S. anginosus分离株中最显著的表型是对面板中代表的两种SalA相关产生菌活性的选择性降低敏感性。对于每种产生菌株，0/12株S. anginosus分离株在任一实验运行中显示抑制。这种缺乏抑制并未伴随对产生菌面板的普遍不敏感：相同分离株对其他产生菌相关抑制活性显示 substantial 敏感性。例如，K12相关活性抑制全部12株S. anginosus分离株，SK648相关活性抑制全部12株，#36菌株相关活性也抑制全部12株。FF22相关活性在运行1和运行2中均抑制7/12株分离株。相比之下，M18、71–679/Ind5、emm86和Sal9对S. anginosus分离株不产生抑制。值得注意的是，由SalB相关活性代表的两种产生菌（K12和SK648）均抑制全部12株S. anginosus分离株，而由SalA或Sal9相关活性代表的产生菌则未抑制。由于延迟拮抗试验测量净产生菌相关活性，该模式是产生菌表型水平的关联，并不确立任何单个肽的因果作用。对M76/streptin相关和M57相关活性的反应更为有限和可变。第四，当代指示菌组之间的对比敏感性配置。S. anginosus和S. mitis的总体阳性相互作用率相似，但与S. pyogenes不同。在第一次运行中，阳性反应（+、++或+++评分）在S. anginosus产生菌-指示菌组合中占40.0%（95%聚类bootstrap置信区间35.8–44.2%），S. mitis组合中占38.3%（31.7–45.8%），S. pyogenes组合中占78.5%（73.1–83.8%）。第二次运行中相应值分别为40.8%（36.7–45.0%）、41.7%（33.3–50.0%）和78.5%（73.1–83.8%）。组间区别主要在于对特定产生菌活性的反应配置，而非总体敏感性的简单差异。基于距离的多变量分析支持敏感性空间中组相关结构。使用城市街区距离和37株当代指示菌，PERMANOVA在运行1中给出pseudo-F(2, 34) = 39.52，R2 = 0.699，p = 0.0001；运行2中pseudo-F(2, 34) = 38.46，R2 = 0.693，p = 0.0001。PERMDISP在运行1中不显著（F = 4.21，p = 0.0887），但在运行2中显著（F = 7.09，p = 0.0275），因此PERMANOVA发现不应解释为仅反映质心差异。Holm校正的成对PERMANOVA在两次运行中对全部三个组对均显著（校正p = 0.0003）。 presence/absence敏感性分析显示相同的定性组相关模式。主坐标分析显示两个独立运行的结果。第五，历史指示菌与P/S框架的连续性。九株历史指示菌I1–I9作为实验矩阵的独立组分保留，以保持与原始P/S敏感性指纹图谱框架的连续性。其纳入表明当前分析与历史产生菌-指示菌系统保持联系，同时将分析扩展到当代S. anginosus、S. mitis和S. pyogenes收藏。

讨论部分总结如下：本研究的主要发现是，对定义链球菌抑制活性库的敏感性可构成可重复的多维表型。在十株产生菌、46株指示菌矩阵中，所检查的分离株表现出敏感性和降低敏感性的选择性组合，而非从细菌素敏感到细菌素抗性的简单连续体。这些模式在两次独立进行的延迟拮抗实验之间可重复，为将比较敏感性视为结构化表型提供了经验基础。这一观察具有明确的历史先例。Tagg和Bannister通过表征细菌素样抑制物质产生和对定义标准菌株所产生抑制活性的敏感性，开发了链球菌P/S指纹图谱方案。Tompkins和Tagg随后通过观察携带高比例细菌素产生唾液链球菌的个体同时携带较高比例的 relative resistant 伴随革兰阳性球菌，为该敏感性维度提供了生态背景。本研究从不同分析角度重新审视这一敏感性组分。CSL概念因此不代表新的实验试验或新证明的分子防御系统，其目的是提供一个描述性框架，用于表示多维敏感性表型并将该表型与可能产生它的机制及可能随之而来的生态后果区分开来。S. anginosus分离株提供了本数据集中选择性降低敏感性的最清晰例子。它们不受面板中代表的两种SalA相关产生菌活性的影响，同时对若干替代活性保持敏感。这种配置用"细菌素抗性"这样的简单标签来描述是不恰当的，因为表型是选择性的而非普遍性的。解释必须保持在表型水平。延迟拮抗试验测量实验条件下与产生菌株相关的净抑制活性，不分离纯化肽或确立产生菌相关活性的哪个组分负责观察到的抑制。因此，本研究将发现描述为对SalA相关产生菌活性的降低敏感性，而非证明的SalA抗性。若干机制可产生这种表型，包括同源免疫或免疫相关蛋白、细胞靶标或受体差异、细胞包膜特性、调节状态和生理条件。细菌素产生生物体遇到的是预先存在的敏感和相对不受影响生物体的分布。如果产生菌相关抑制活性抑制群落中某些成员而对其他成员影响很小，则保持不受影响的生物体可能变得相对更突出。这为选择性敏感性提供了合理的生态解释，但本研究未直接证明。CSL框架为考虑这种相互作用提供了表型层面，但它不构成完整的生态相互作用网络，因为本实验既未包含空间结构，也未包含口腔的时间、营养和群落背景。面板依赖性是该框架的基本特征而非偶然特征。不同的产生菌株集合可能揭示不同的敏感性景观。因此CSL不被提出为独立于其挑战环境的物种或菌株的内在属性；它是相对于指定抑制库和试验的敏感性表示。S. anginosus分离株对SalA相关产生菌活性的选择性降低敏感性提供了该框架特别可检验的例子。该表型可能反映共享的分子决定因素、趋同的生理特性、细胞包膜结构差异或对相关抑制系统的历史暴露。本数据集无法区分这些可能性。近年来S. anginosus的基因组和转录组工作突出了与适应和毒力相关的 substantial 遗传和调节复杂性。虽然本研究的分离株未进行基因组分析，但这些资源为未来基因型-表型比较提供了明显途径。产生菌面板不限于单一类别的细菌素，包括历史上与salivaricin和其他羊毛硫抗生素活性相关的菌株，以及streptococcin A-FF22、streptin、SA-M57相关活性和广谱BLIS活性。因此所得敏感性景观反映了刻意多样的产生菌库，而非仅关注羊毛硫抗生素。当考虑将细菌素产生生物体作为益生菌或微生物替换策略的组分时，常驻微生物群落的敏感性配置可能相关。产生菌只能对对该相关产生菌活性敏感的生物体施加抑制效应。因此，引入细菌素产生菌株的生态后果可能部分取决于目标群落预先存在的敏感性分布。这一观察不应解释为CSL预测益生菌定植或临床疗效的证据。本研究未测量定植、群落组装、持久性或临床结果。相反，比较敏感性谱分析可提供一层信息，在评估细菌素产生益生菌如何与常驻微生物群相互作用时可与基因组、空间和群落水平测量相结合。本研究存在若干局限性。第一，延迟拮抗试验测量产生菌相关抑制活性而非纯化单个细菌素的活性，因此产生菌株内个体肽的贡献仍未解决。第二，试验在定义实验室条件下进行，无法重现口腔的空间、营养、时间和理化复杂性。第三，指示菌收藏来自已建立的历史和研究收藏，并非设计为群体代表性样本，因此观察到的频率描述所检查的分离株而非物种范围分布。第四，序数评分系统基于抑制圈特征的视觉评估，尽管运行间可重复性高，但研究未包括正式的多观察者评估，观察者相关变异不能排除。第五，CSL依赖于产生菌面板，不同面板将产生不同敏感性表示。第六，未对指示菌株进行基因组解析分析或肽特异性功能实验。最后，延迟拮抗活性是净表型，本身不能排除试验条件下产生菌相关非细菌素抑制因子的贡献。这些局限性直接指向下一步实验步骤。基因组解析比较可鉴定与敏感性模式相关的候选决定因素；纯化肽试验和同源突变体可检验肽特异性机制；扩展的产生菌和指示菌面板可确定观察到的景观在挑战库中的稳定性；群落或纵向研究可检验可重复敏感性模式是否对微生物组装或持久性有可测量后果。